摘要

了解(jie)DNA/脂(zhi)質(zhi)相互(hu)作(zuo)用(yong)的(de)(de)(de)(de)分(fen)子機制對于優(you)(you)化脂(zhi)質(zhi)輔因(yin)子在基因(yin)治療中(zhong)的(de)(de)(de)(de)應用(yong)至(zhi)關重要。在這里我們(men)(men)通(tong)過(guo)使用(yong)無標(biao)簽振(zhen)動和(he)(he)(he)頻（VSF）光譜來研(yan)究DNA與(yu)陽離子脂(zhi)質(zhi)DPTAP（1,2-二(er)棕櫚酰-3-三甲(jia)基銨-丙(bing)烷(wan)）和(he)(he)(he)二(er)氫14-氨基以及兩(liang)性(xing)離子脂(zhi)質(zhi)DPPC（1,2-二(er)棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿）的(de)(de)(de)(de)脂(zhi)質(zhi)單(dan)層的(de)(de)(de)(de)相互(hu)作(zuo)用(yong)來解(jie)決(jue)這個(ge)問題缺(que)鈣。我們(men)(men)的(de)(de)(de)(de)方法的(de)(de)(de)(de)優(you)(you)點是既能明確探測分(fen)子間的(de)(de)(de)(de)相互(hu)作(zuo)用(yong)，又能洞察(cha)脂(zhi)質(zhi)界面(mian)DNA周圍的(de)(de)(de)(de)水和(he)(he)(he)脂(zhi)質(zhi)結構。通(tong)過(guo)研(yan)究界面(mian)D2O的(de)(de)(de)(de)OD延伸，我們(men)(men)發現，含(han)有(you)吸(xi)附(fu)在陽離子上(shang)的(de)(de)(de)(de)DNA的(de)(de)(de)(de)系(xi)(xi)統和(he)(he)(he)含(han)有(you)吸(xi)附(fu)在兩(liang)性(xing)離子脂(zhi)質(zhi)單(dan)層上(shang)的(de)(de)(de)(de)DNA的(de)(de)(de)(de)系(xi)(xi)統（在存在或不存在Ca2+的(de)(de)(de)(de)情(qing)況下）的(de)(de)(de)(de)水結構存在顯(xian)著差異。陽離子體系(xi)(xi)中(zhong)界面(mian)水的(de)(de)(de)(de)光譜響應與(yu)高度結構化、欠(qian)協調、結構化的(de)(de)(de)(de)“類型”水一致。此外，通(tong)過(guo)對雙14-酰胺脂(zhi)尾(wei)的(de)(de)(de)(de)CH拉伸模(mo)式的(de)(de)(de)(de)研(yan)究，我們(men)(men)證明DNA對該脂(zhi)的(de)(de)(de)(de)吸(xi)附(fu)導致脂(zhi)尾(wei)的(de)(de)(de)(de)有(you)序性(xing)增加。

介紹

控制(zhi)特定(ding)基因(yin)(yin)轉(zhuan)染(ran)的(de)能(neng)力(li)具有(you)巨大的(de)潛(qian)在治療效益。應對(dui)這(zhe)一挑戰(zhan)的(de)一種方(fang)法是(shi)使用(yong)(yong)轉(zhuan)基因(yin)(yin)病毒，也就是(shi)借用(yong)(yong)進化論的(de)解決(jue)方(fang)案來應對(dui)生(sheng)物(wu)物(wu)理挑戰(zhan)，即將(jiang)遺(yi)傳物(wu)質(zhi)從細(xi)(xi)胞(bao)外(wai)、穿過(guo)質(zhi)膜進入(ru)(ru)細(xi)(xi)胞(bao)核(he)。雖然這(zhe)種基因(yin)(yin)轉(zhuan)染(ran)方(fang)法非常有(you)效，但(dan)它不(bu)僅對(dui)特定(ding)類型(xing)的(de)細(xi)(xi)胞(bao)具有(you)特異性，而(er)且常常會產生(sheng)意想不(bu)到(dao)的(de)毒副作用(yong)(yong)。1-5由于這(zhe)些原因(yin)(yin)，在過(guo)去的(de)20年里(li)，人們投入(ru)(ru)了(le)大量精力(li)來合(he)成輔因(yin)(yin)子(zi)，這(zhe)些輔因(yin)(yin)子(zi)與細(xi)(xi)胞(bao)外(wai)的(de)DNA復合(he)，并將(jiang)其引導至細(xi)(xi)胞(bao)核(he)。由于通用(yong)(yong)性（適用(yong)(yong)于多(duo)種細(xi)(xi)胞(bao)類型(xing)）、效率（需要相對(dui)少(shao)量的(de)DNA）和無(wu)毒性的(de)要求，工程(cheng)化這(zhe)些輔因(yin)(yin)子(zi)是(shi)一項挑戰(zhan)。

為(wei)了理(li)解(jie)挑戰(zhan)(zhan)，有助(zhu)于考慮(lv)這樣的(de)(de)(de)輔助(zhu)因(yin)(yin)子(zi)(zi)(zi)(zi)應(ying)該(gai)具備的(de)(de)(de)性(xing)質(zhi)。溶液中(zhong)(zhong)(zhong)形成的(de)(de)(de)復(fu)合(he)(he)物應(ying)在(zai)細(xi)胞外(wai)穩(wen)定(ding)，并(bing)應(ying)促進多陰離(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)(zi)DNA與帶負電(dian)(dian)(dian)質(zhi)膜外(wai)小(xiao)葉的(de)(de)(de)相互作用。接(jie)下來，在(zai)細(xi)胞攝取后(hou)，復(fu)合(he)(he)物應(ying)該(gai)有助(zhu)于穩(wen)定(ding)DNA，直到擴(kuo)散使其接(jie)近細(xi)胞核。最后(hou)，復(fu)合(he)(he)物應(ying)足夠不穩(wen)定(ding)，當相對靠近細(xi)胞核時，DNA將釋放(fang)到細(xi)胞質(zhi)中(zhong)(zhong)(zhong)。繼15-20年前Felgner等(deng)人的(de)(de)(de)開創(chuang)性(xing)研(yan)(yan)究(jiu)之后(hou)，關(guan)于這一挑戰(zhan)(zhan)的(de)(de)(de)大部分工作都(dou)集中(zhong)(zhong)(zhong)在(zai)使用陽(yang)離(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)(zi)脂(zhi)(zhi)質(zhi)作為(wei)絡合(he)(he)劑上。選擇(ze)6,7陽(yang)離(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)(zi)脂(zhi)(zhi)質(zhi)是(shi)因(yin)(yin)為(wei)它們在(zai)溶液中(zhong)(zhong)(zhong)與聚陰離(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)(zi)DNA形成不帶正電(dian)(dian)(dian)荷(he)或稍帶正電(dian)(dian)(dian)荷(he)的(de)(de)(de)穩(wen)定(ding)聚集體(ti)(ti)（脂(zhi)(zhi)復(fu)合(he)(he)物）。因(yin)(yin)此，脂(zhi)(zhi)復(fu)合(he)(he)物通過降(jiang)低DNA的(de)(de)(de)陰離(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)(zi)性(xing)質(zhi)，從(cong)(cong)而降(jiang)低DNA接(jie)近質(zhi)膜的(de)(de)(de)靜(jing)電(dian)(dian)(dian)屏障，從(cong)(cong)而滿足合(he)(he)成輔助(zhu)因(yin)(yin)子(zi)(zi)(zi)(zi)的(de)(de)(de)第(di)一個要求。將這種(zhong)脂(zhi)(zhi)復(fu)合(he)(he)物的(de)(de)(de)轉(zhuan)染(ran)效(xiao)率的(de)(de)(de)體(ti)(ti)內研(yan)(yan)究(jiu)結(jie)果與類(lei)似復(fu)合(he)(he)物的(de)(de)(de)體(ti)(ti)外(wai)結(jie)構(gou)研(yan)(yan)究(jiu)結(jie)果進行(xing)比(bi)較，已闡明跨質(zhi)膜的(de)(de)(de)基(ji)因(yin)(yin)轉(zhuan)移(yi)主要通過內吞(tun)作用進行(xing)，而內體(ti)(ti)的(de)(de)(de)轉(zhuan)移(yi)效(xiao)率是(shi)聚集體(ti)(ti)結(jie)構(gou)和電(dian)(dian)(dian)荷(he)的(de)(de)(de)函數類(lei)脂(zhi)(zhi)頭型(xing)。8-11脂(zhi)(zhi)叢結(jie)構(gou)的(de)(de)(de)體(ti)(ti)外(wai)研(yan)(yan)究(jiu)，主要是(shi)X射線、中(zhong)(zhong)(zhong)子(zi)(zi)(zi)(zi)和粗粒度(du)計算研(yan)(yan)究(jiu)，已闡明通過改變(bian)(bian)陽(yang)離(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)(zi)脂(zhi)(zhi)質(zhi)頭基(ji)的(de)(de)(de)電(dian)(dian)(dian)荷(he)，改變(bian)(bian)陽(yang)離(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)(zi)與兩(liang)性(xing)脂(zhi)(zhi)質(zhi)的(de)(de)(de)比(bi)例（在(zai)由(you)兩(liang)性(xing)脂(zhi)(zhi)質(zhi)+陽(yang)離(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)(zi)脂(zhi)(zhi)質(zhi)+DNA組成的(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)叢中(zhong)(zhong)(zhong)），可以靈(ling)敏(min)地調整結(jie)構(gou)，改變(bian)(bian)脂(zhi)(zhi)質(zhi)-DNA比(bi)率，改變(bian)(bian)小(xiao)離(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)(zi)的(de)(de)(de)價態(tai)和濃(nong)度(du)也存在(zai)。12-27

雖然(ran)體(ti)內(nei)(nei)(nei)轉染和(he)(he)成像研(yan)究(jiu)以及體(ti)外結構(gou)(gou)研(yan)究(jiu)對(dui)于通過合(he)成載體(ti)優化基因轉染非常重要，但(dan)此類(lei)研(yan)究(jiu)揭(jie)示的(de)(de)(de)信息(xi)有(you)限(xian)(xian)。例如(ru)，總的(de)(de)(de)來說，這(zhe)(zhe)些方(fang)法對(dui)脂(zhi)(zhi)質(zhi)體(ti)形成的(de)(de)(de)自由能或(huo)脂(zhi)(zhi)質(zhi)體(ti)內(nei)(nei)(nei)部或(huo)脂(zhi)(zhi)質(zhi)體(ti)與內(nei)(nei)(nei)體(ti)之間(jian)的(de)(de)(de)詳細分(fen)(fen)子水平相(xiang)互作(zuo)用(yong)(yong)等潛在(zai)(zai)重要問(wen)題(ti)提(ti)供(gong)了(le)(le)(le)有(you)限(xian)(xian)的(de)(de)(de)見解(jie)(jie)。為了(le)(le)(le)克服前者的(de)(de)(de)缺點，進行了(le)(le)(le)一(yi)(yi)系(xi)列的(de)(de)(de)量(liang)熱法、28-31壓力等溫線和(he)(he)石(shi)英(ying)晶體(ti)微(wei)天平測(ce)量(liang)。31,33了(le)(le)(le)解(jie)(jie)DNA/脂(zhi)(zhi)質(zhi)/界面(mian)水相(xiang)互作(zuo)用(yong)(yong)的(de)(de)(de)分(fen)(fen)子細節(jie)如(ru)何影(ying)(ying)響脂(zhi)(zhi)質(zhi)復合(he)體(ti)結構(gou)(gou)，了(le)(le)(le)解(jie)(jie)分(fen)(fen)子水平信息(xi)如(ru)何影(ying)(ying)響納米(mi)到微(wei)米(mi)尺度(du)的(de)(de)(de)結構(gou)(gou)，然(ran)而(er)，更為復雜。在(zai)(zai)計(ji)算領域(yu)，這(zhe)(zhe)類(lei)研(yan)究(jiu)具有(you)挑戰性，因為問(wen)題(ti)是(shi)多尺度(du)的(de)(de)(de)：理想情(qing)況(kuang)下(xia)，人們希望深入了(le)(le)(le)解(jie)(jie)發生(sheng)在(zai)(zai)數百飛秒到分(fen)(fen)鐘(zhong)的(de)(de)(de)時間(jian)尺度(du)和(he)(he)埃到毫(hao)米(mi)的(de)(de)(de)空(kong)間(jian)尺度(du)上的(de)(de)(de)過程(cheng)。24在(zai)(zai)實驗(yan)(yan)領域(yu)，找到既(ji)能充分(fen)(fen)發揮(hui)表面(mian)敏感性又能發揮(hui)特異(yi)性的(de)(de)(de)方(fang)法是(shi)一(yi)(yi)項挑戰。幾(ji)位作(zuo)者利用(yong)(yong)熒(ying)光技術解(jie)(jie)決了(le)(le)(le)這(zhe)(zhe)個方(fang)程(cheng)的(de)(de)(de)靈敏度(du)部分(fen)(fen)，盡管不(bu)是(shi)表面(mian)特異(yi)性。34-36雖然(ran)這(zhe)(zhe)些研(yan)究(jiu)提(ti)供(gong)了(le)(le)(le)對(dui)膜水合(he)作(zuo)用(yong)(yong)和(he)(he)流動性的(de)(de)(de)洞察，但(dan)這(zhe)(zhe)些結論通常都(dou)是(shi)間(jian)接的(de)(de)(de)（通過對(dui)熒(ying)光團響應(ying)的(de)(de)(de)變化及其局部分(fen)(fen)子環(huan)境的(de)(de)(de)變化進行經(jing)驗(yan)(yan)校準得出），并且需要使用(yong)(yong)可(ke)能干擾這(zhe)(zhe)一(yi)(yi)微(wei)妙(miao)系(xi)統的(de)(de)(de)熒(ying)光標記。

關于脂叢(cong)中分子(zi)水平相互作(zuo)用的(de)信息可以(yi)通過振動光譜以(yi)無標(biao)記(ji)的(de)方(fang)式直接獲得(de)。為(wei)了(le)實現這一目標(biao)，幾位作(zuo)者對各種DNA/脂質系統進行了(le)紅(hong)外吸光度(du)測量。17,18,37該方(fang)法(fa)主要用于通過量化(hua)DNA特定官能團的(de)吸光度(du)來測量表面的(de)DNA量。然而，由于紅(hong)外吸收缺乏固有的(de)表面敏感性/特異性，很少有人嘗試利用DNA、脂質或(huo)界面水模式的(de)振動光譜響應的(de)變化(hua)來理解DNA與脂質的(de)絡合(he)。

在(zai)這(zhe)項研究中(zhong)，我們通過(guo)應用(yong)(yong)振(zhen)(zhen)動和(he)(he)(he)頻產生(sheng)(sheng)（VSF）光(guang)(guang)譜(pu)來獲(huo)得DNA、脂(zhi)質(zhi)和(he)(he)(he)界(jie)面(mian)水(shui)之間(jian)相(xiang)(xiang)互(hu)作(zuo)(zuo)用(yong)(yong)的(de)(de)(de)分(fen)(fen)子水(shui)平圖像，從而克服了表面(mian)特異性/敏(min)感性的(de)(de)(de)挑(tiao)戰。VSF是(shi)一(yi)(yi)種二(er)階非(fei)(fei)(fei)線(xian)性光(guang)(guang)學技術，其中(zhong)脈沖可見光(guang)(guang)和(he)(he)(he)紅外激光(guang)(guang)束(shu)在(zai)空間(jian)和(he)(he)(he)時間(jian)的(de)(de)(de)界(jie)面(mian)上重(zhong)疊，并(bing)(bing)在(zai)兩(liang)個輸入頻率的(de)(de)(de)總和(he)(he)(he)上產生(sheng)(sheng)發(fa)射。根(gen)據對(dui)稱(cheng)性選擇規(gui)則，和(he)(he)(he)頻過(guo)程是(shi)特定于界(jie)面(mian)的(de)(de)(de)（在(zai)具(ju)有反轉對(dui)稱(cheng)性的(de)(de)(de)體相(xiang)(xiang)之間(jian)），并(bing)(bing)且是(shi)振(zhen)(zhen)動光(guang)(guang)譜(pu)，因為當紅外光(guang)(guang)束(shu)的(de)(de)(de)能量與界(jie)面(mian)分(fen)(fen)子的(de)(de)(de)分(fen)(fen)子振(zhen)(zhen)動共振(zhen)(zhen)時，發(fa)射可以增加許多數量級(ji)。也(ye)就是(shi)說，VSF光(guang)(guang)譜(pu)是(shi)一(yi)(yi)種界(jie)面(mian)特定的(de)(de)(de)振(zhen)(zhen)動光(guang)(guang)譜(pu)，非(fei)(fei)(fei)常適合描述水(shui)界(jie)面(mian)的(de)(de)(de)分(fen)(fen)子結(jie)構(gou)。38-40之前的(de)(de)(de)工作(zuo)(zuo)已(yi)經證明了VSF光(guang)(guang)譜(pu)（及其非(fei)(fei)(fei)共振(zhen)(zhen)模擬二(er)次諧波(bo)產生(sheng)(sheng)（SHG）光(guang)(guang)譜(pu)）的(de)(de)(de)適用(yong)(yong)性，可用(yong)(yong)于定量小(xiao)分(fen)(fen)子（小(xiao)于20 bp）主(zhu)要(yao)是(shi)單組(zu)分(fen)(fen)單鏈和(he)(he)(he)雙鏈DNA的(de)(de)(de)雙鏈形成(cheng)和(he)(he)(he)DNA構(gou)象，共價連接到固體基質(zhi)，41-47以及在(zai)水(shui)/脂(zhi)質(zhi)/空氣界(jie)面(mian)上更長的(de)(de)(de)DNA鏈的(de)(de)(de)脂(zhi)質(zhi)-DNA相(xiang)(xiang)互(hu)作(zuo)(zuo)用(yong)(yong)。48目前的(de)(de)(de)研究表明，VSF光(guang)(guang)譜(pu)有助于闡(chan)明脂(zhi)質(zhi)、界(jie)面(mian)水(shui)和(he)(he)(he)任意組(zu)成(cheng)的(de)(de)(de)DNA鏈之間(jian)的(de)(de)(de)分(fen)(fen)子水(shui)平相(xiang)(xiang)互(hu)作(zuo)(zuo)用(yong)(yong)。

盡管如上所述(shu)，有很多證據表明脂質(zhi)(zhi)(zhi)復合物(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)結構和(he)轉染(ran)效(xiao)率是脂質(zhi)(zhi)(zhi)頭基(ji)電荷密度的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)函(han)數（對于(yu)(yu)陽離(li)(li)子(zi)脂質(zhi)(zhi)(zhi)），但并非(fei)所有陽離(li)(li)子(zi)脂質(zhi)(zhi)(zhi)都適(shi)(shi)合這(zhe)種(zhong)(zhong)(zhong)應(ying)用(yong)(yong)。一(yi)般來說，轉染(ran)效(xiao)率的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)提(ti)高（隨著(zhu)脂質(zhi)(zhi)(zhi)濃度的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)增加）和(he)細胞毒(du)性（部分原因(yin)是脂質(zhi)(zhi)(zhi)和(he)硫酸化表面(mian)蛋白多糖組之間(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)相(xiang)互(hu)(hu)作用(yong)(yong)10）之間(jian)存(cun)在(zai)權(quan)衡。事實上，我(wo)(wo)(wo)們之前研(yan)究(jiu)中使用(yong)(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)陽離(li)(li)子(zi)脂質(zhi)(zhi)(zhi)，48 1,1-二棕櫚酰(xian)(xian)-3-三甲基(ji)丙烷銨（DPTAP），已知在(zai)遠低(di)于(yu)(yu)可觀(guan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)因(yin)轉染(ran)所需濃度時(shi)對哺乳動(dong)物(wu)細胞有毒(du)。在(zai)這(zhe)里(li)，我(wo)(wo)(wo)們通過(guo)(guo)進(jin)一(yi)步報道DNA與(yu)(yu)（i）陽離(li)(li)子(zi)脂質(zhi)(zhi)(zhi)diC14-氨基(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)相(xiang)互(hu)(hu)作用(yong)(yong)來擴(kuo)展我(wo)(wo)(wo)們之前的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)工(gong)作，過(guo)(guo)去15年(nian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)大量工(gong)作證明了(le)其低(di)毒(du)性和(he)基(ji)因(yin)轉染(ran)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)適(shi)(shi)用(yong)(yong)性；49和(he)（ii）無(wu)(wu)毒(du)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)兩性離(li)(li)子(zi)脂質(zhi)(zhi)(zhi)二棕櫚酰(xian)(xian)磷脂酰(xian)(xian)膽(dan)堿（DPPC），無(wu)(wu)論是否存(cun)在(zai)鈣(gai)（其中研(yan)究(jiu)了(le)鈣(gai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)添(tian)加，因(yin)為之前的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)各種(zhong)(zhong)(zhong)研(yan)究(jiu)已經證明，在(zai)存(cun)在(zai)這(zhe)種(zhong)(zhong)(zhong)離(li)(li)子(zi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)情(qing)況下，DNA和(he)DPPC之間(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)相(xiang)互(hu)(hu)作用(yong)(yong)變得更有利16-19,31,33,50）。我(wo)(wo)(wo)們通過(guo)(guo)監測DNA吸附時(shi)OD拉伸（在(zai)界面(mian)D2O或(huo)HOD中）的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)振(zhen)(zhen)動(dong)振(zhen)(zhen)幅和(he)線(xian)形(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)變化，直接跟蹤DNA與(yu)(yu)每種(zhong)(zhong)(zhong)脂質(zhi)(zhi)(zhi)類型的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)相(xiang)互(hu)(hu)作用(yong)(yong)。我(wo)(wo)(wo)們發現，與(yu)(yu)之前采用(yong)(yong)其他(ta)技(ji)術的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)研(yan)究(jiu)一(yi)致，這(zhe)種(zhong)(zhong)(zhong)相(xiang)互(hu)(hu)作用(yong)(yong)本質(zhi)(zhi)(zhi)上主要是靜電作用(yong)(yong)：陽離(li)(li)子(zi)脂質(zhi)(zhi)(zhi)與(yu)(yu)DNA的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)相(xiang)互(hu)(hu)作用(yong)(yong)類似(si)，并且這(zhe)種(zhong)(zhong)(zhong)相(xiang)互(hu)(hu)作用(yong)(yong)在(zai)鈣(gai)存(cun)在(zai)和(he)不(bu)存(cun)在(zai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)情(qing)況下都不(bu)同(tong)于(yu)(yu)DNA和(he)DPPC。

此外(wai)，由(you)于(yu)(yu)我們對雙(shuang)(shuang)14-氨基(ji)特別感興趣，我們還量化(hua)了(le)DNA與該單層的(de)(de)(de)(de)相(xiang)(xiang)互(hu)作用(yong)如何導致脂(zhi)質尾(wei)部的(de)(de)(de)(de)有序化(hua)（通過(guo)VSF光(guang)譜(pu)和壓力/面積等溫(wen)(wen)線）。在(zai)之(zhi)前(qian)的(de)(de)(de)(de)一項研(yan)究中，Benatti及其(qi)同事利用(yong)電子(zi)自(zi)旋共振光(guang)譜(pu)和自(zi)旋標記脂(zhi)質探索(suo)了(le)DNA在(zai)雙(shuang)(shuang)氰胺(an)雙(shuang)(shuang)分子(zi)層相(xiang)(xiang)上(shang)的(de)(de)(de)(de)吸(xi)(xi)附(fu)(fu)效應，以及溫(wen)(wen)度對吸(xi)(xi)附(fu)(fu)的(de)(de)(de)(de)影響。這(zhe)項研(yan)究的(de)(de)(de)(de)結果(guo)表(biao)明，DNA的(de)(de)(de)(de)吸(xi)(xi)附(fu)(fu)使(shi)凝膠(jiao)相(xiang)(xiang)雙(shuang)(shuang)14胺(an)（低于(yu)(yu)23°C）流(liu)(liu)態化(hua)，并使(shi)流(liu)(liu)體雙(shuang)(shuang)層（高(gao)于(yu)(yu)23°C）：隨著溫(wen)(wen)度的(de)(de)(de)(de)升(sheng)高(gao)，DNA的(de)(de)(de)(de)吸(xi)(xi)附(fu)(fu)起到了(le)平(ping)滑凝膠(jiao)/流(liu)(liu)體相(xiang)(xiang)變的(de)(de)(de)(de)作用(yong)。因此，我們的(de)(de)(de)(de)VSF觀察(cha)結果(guo)提供了(le)一個分子(zi)水平(ping)的(de)(de)(de)(de)視(shi)圖，使(shi)用(yong)一個無標記的(de)(de)(de)(de)實驗(yan)探針，觀察(cha)了(le)伴隨這(zhe)一diC14氨基(ji)/DNA相(xiang)(xiang)的(de)(de)(de)(de)脂(zhi)質尾(wei)部結構的(de)(de)(de)(de)變化(hua)。總的(de)(de)(de)(de)來說，這(zhe)些(xie)(xie)結果(guo)表(biao)明，VSF光(guang)譜(pu)學在(zai)脂(zhi)叢形成(cheng)研(yan)究中的(de)(de)(de)(de)應用(yong)使(shi)我們能夠(gou)看到脂(zhi)叢結構的(de)(de)(de)(de)各個方面，而(er)這(zhe)些(xie)(xie)方面很(hen)難通過(guo)其(qi)他手段進(jin)行研(yan)究，因此，VSF光(guang)譜(pu)學是優化(hua)合(he)成(cheng)基(ji)因治療的(de)(de)(de)(de)有用(yong)工具。

方法

實(shi)(shi)驗細(xi)節(jie)。本研究中(zhong)使(shi)用(yong)(yong)的(de)(de)(de)D2O是從(cong)劍橋(qiao)同位素實(shi)(shi)驗室(shi)（MA）獲得的(de)(de)(de)，純度(du)為(wei)99.96%，用(yong)(yong)于接(jie)(jie)收。對本研究中(zhong)使(shi)用(yong)(yong)的(de)(de)(de)H2O進行(xing)蒸(zheng)餾(liu)，然后(hou)(hou)使(shi)用(yong)(yong)微(wei)孔(kong)裝置(zhi)進行(xing)過(guo)濾，最終電阻率(lv)為(wei)18.2m?·厘米1,2-二棕櫚酰-3-三(san)甲(jia)基銨-丙烷（DPTAP）和1,2-二棕櫚酰-sn-甘油(you)-3-磷酸膽堿（DPPC）從(cong)Avanti Polar Lipses（AL）購(gou)買，前者(zhe)作為(wei)氯鹽，并在(zai)收到時使(shi)用(yong)(yong)。使(shi)用(yong)(yong)之前發布的(de)(de)(de)程序49合(he)成了(le)雙(shuang)氰(qing)胺（所(suo)有脂(zhi)質結構見(jian)圖1）。λ-噬菌體DNA（每個分子的(de)(de)(de)長(chang)度(du)由制造商指定(ding)為(wei)48 502個堿基對）從(cong)德國酵素公(gong)司(si)購(gou)買，并在(zai)H2O中(zhong)接(jie)(jie)收。在(zai)我們的(de)(de)(de)大多數實(shi)(shi)驗中(zhong)，我們需要D2O中(zhong)的(de)(de)(de)DNA。為(wei)此，使(shi)用(yong)(yong)QIAEX II凝膠提(ti)取試劑盒（Qiagen）從(cong)H2O中(zhong)提(ti)取DNA，然后(hou)(hou)溶解(jie)在(zai)TRIS緩沖D2O（10 mM TRIS HCl，pD）7中(zhong)。該程序重復三(san)次，以確保低濃(nong)度(du)的(de)(de)(de)H2O和最終的(de)(de)(de)DNA回(hui)收≈80%（通過(guo)260 nm處的(de)(de)(de)DNA吸光度(du)進行(xing)量化）。我們沒有確認該樣(yang)本制備程序保留了(le)DNA鏈長(chang)度(du)。

圖1.（A）雙14酰胺的分子(zi)結(jie)構；（B）DPTAP；和(he)（C）DPPC。

我們的(de)VSF光(guang)(guang)(guang)(guang)譜(pu)(pu)設置已經在(zai)前(qian)面詳(xiang)細描述(shu)過(guo)。51簡言之(zhi)，我們采用(yong)了一種再(zai)生放大鈦寶(bao)石(shi)系統(tong)（Legend，Coherent，Inc.），該系統(tong)經過(guo)優化(hua)，可用(yong)于(yu)(yu)(yu)生產(chan)鈦寶(bao)石(shi)≈100fs脈沖，中(zhong)心波(bo)(bo)長(chang)為800nm，帶寬為12nm；使用(yong)商用(yong)光(guang)(guang)(guang)(guang)學參量(liang)放大器(qi)和(he)(he)差頻產(chan)生裝置（TOPAS，light Conversion，立陶宛(wan)）將800 nm光(guang)(guang)(guang)(guang)的(de)1 mJ/脈沖用(yong)于(yu)(yu)(yu)產(chan)生可調(diao)諧的(de)中(zhong)紅(hong)外(wai)脈沖，而使用(yong)一個(ge)或(huo)兩個(ge)標準具(ju)（用(yong)于(yu)(yu)(yu)聚(ju)焦(jiao)于(yu)(yu)(yu)CH拉伸(shen)的(de)測量(liang)）將0.5 mJ的(de)光(guang)(guang)(guang)(guang)譜(pu)(pu)變(bian)窄。在(zai)產(chan)生IR和(he)(he)800 nm光(guang)(guang)(guang)(guang)譜(pu)(pu)變(bian)窄后，兩束(shu)光(guang)(guang)(guang)(guang)束(shu)都(dou)通過(guo)半波(bo)(bo)片和(he)(he)偏(pian)(pian)振器(qi)，并以相(xiang)對于(yu)(yu)(yu)表面法線（分(fen)別為IR和(he)(he)可見光(guang)(guang)(guang)(guang)）40°和(he)(he)35°的(de)反射幾何結構撞擊樣品。采樣后，過(guo)濾掉所(suo)有剩(sheng)余的(de)800 nm光(guang)(guang)(guang)(guang)，將VSF信號聚(ju)焦(jiao)到(dao)光(guang)(guang)(guang)(guang)譜(pu)(pu)儀（Acton Instruments）中(zhong)，在(zai)光(guang)(guang)(guang)(guang)譜(pu)(pu)儀中(zhong)通過(guo)光(guang)(guang)(guang)(guang)柵(zha)將其(qi)分(fen)散，并聚(ju)焦(jiao)到(dao)電子倍增電荷(he)耦合器(qi)件(jian)（emCCD）攝像機（牛(niu)頓和(he)(he)或(huo)）上。本研究中(zhong)報告的(de)所(suo)有光(guang)(guang)(guang)(guang)譜(pu)(pu)均在(zai)ssp偏(pian)(pian)振條(tiao)件(jian)下收集（s偏(pian)(pian)振SF、s偏(pian)(pian)振可見光(guang)(guang)(guang)(guang)、p偏(pian)(pian)振紅(hong)外(wai)）。所(suo)有測量(liang)均在(zai)21.5°C下進(jin)行。

在(zai)這(zhe)項研(yan)究中(zhong)，我(wo)們對(dui)OD和CH拉伸(shen)區域的(de)(de)(de)光(guang)譜響應(ying)感(gan)興趣，分別為紅外(wai)頻(pin)率(lv)的(de)(de)(de)2100-2700和2800-3000 cm-1。由于紅外(wai)光(guang)源(yuan)的(de)(de)(de)帶寬小于OD拉伸(shen)振動的(de)(de)(de)線寬，我(wo)們需要通(tong)(tong)過(guo)系統(tong)地(di)改變(bian)TOPAS中(zhong)兩(liang)個非線性(xing)晶(jing)體(ti)相對(dui)于入(ru)射(she)光(guang)的(de)(de)(de)角度來掃描紅外(wai)頻(pin)率(lv)。這(zhe)個過(guo)程(cheng)的(de)(de)(de)結果是，紅外(wai)功(gong)率(lv)在(zai)我(wo)們期望的(de)(de)(de)頻(pin)率(lv)范圍內(nei)是不(bu)(bu)均勻(yun)(yun)的(de)(de)(de)。我(wo)們通(tong)(tong)過(guo)將所有脂(zhi)質(zhi)/DNA光(guang)譜除以(yi)(yi)相同頻(pin)率(lv)范圍內(nei)的(de)(de)(de)光(guang)譜（從z切石英測量）來糾正(zheng)這(zhe)種不(bu)(bu)均勻(yun)(yun)性(xing)。我(wo)們的(de)(de)(de)TOPAS/差頻(pin)發生器在(zai)產(chan)生3400 cm-1以(yi)(yi)上頻(pin)率(lv)的(de)(de)(de)光(guang)時效率(lv)相對(dui)較低。正(zheng)是出于這(zhe)個原(yuan)因，我(wo)們研(yan)究了D2O和HOD的(de)(de)(de)OD延(yan)(yan)伸(shen)，而不(bu)(bu)是H2O和HOD的(de)(de)(de)OH延(yan)(yan)伸(shen)。我(wo)們和其他人(ren)的(de)(de)(de)廣泛比(bi)較發現，OD光(guang)譜可以(yi)(yi)線性(xing)縮(suo)放以(yi)(yi)定量恢復(fu)OH光(guang)譜：用(yong)重水(shui)代替光(guang)不(bu)(bu)會影響分子結構(gou)（在(zai)VSF光(guang)譜中(zhong)可見的(de)(de)(de)程(cheng)度）。

之前的(de)(de)一些(xie)(xie)研(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)使用VSF光(guang)譜(pu)法(fa)對含有(you)末端附(fu)著在(zai)固體表面(mian)上(shang)的(de)(de)DNA的(de)(de)系(xi)統(tong)的(de)(de)CH拉伸頻(pin)率(lv)區域進行(xing)了研(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)，報告了來自DNA43,44的(de)(de)VSF活性CH模式(shi)，而其他(ta)研(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)則沒(mei)有(you)。42,45那些(xie)(xie)觀察到(dao)DNA CH模式(shi)的(de)(de)研(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)以其核堿基序列的(de)(de)相對簡短和簡單(dan)而著稱。我們(men)的(de)(de)DNA鏈比這(zhe)些(xie)(xie)研(yan)究(jiu)(jiu)(jiu)中使用的(de)(de)DNA鏈長2000-5000倍，物理吸(xi)附(fu)在(zai)界面(mian)上(shang)（因此可能具有(you)較小(xiao)的(de)(de)長程(cheng)順(shun)序），并且化學(xue)上(shang)不均(jun)勻。這(zhe)些(xie)(xie)考慮(lv)表明，正如我們(men)確實發現的(de)(de)那樣(yang)，在(zai)我們(men)的(de)(de)實驗系(xi)統(tong)中，DNA本身沒(mei)有(you)VSF活性CH模式(shi)。

脂質(zhi)儲備溶(rong)液在(zai)(zai)(zai)氯仿中制(zhi)備。在(zai)(zai)(zai)有(you)無DNA的(de)(de)情況下，通過在(zai)(zai)(zai)含有(you)D2O和(he)tris緩沖液的(de)(de)亞相上(shang)滴加這些(xie)儲備溶(rong)液制(zhi)備單層。光學分析是在(zai)(zai)(zai)自制(zhi)的(de)(de)聚(ju)四(si)氟乙烯槽中制(zhi)備的(de)(de)樣品(pin)上(shang)進行(xing)的(de)(de)。使用商用張力計（芬蘭(lan)基布隆）對(dui)這些(xie)水槽中的(de)(de)表面壓力進行(xing)量(liang)化。高分辨(bian)率(lv)壓力（π）/面積等溫線是在(zai)(zai)(zai)帶有(you)移(yi)動屏(ping)障的(de)(de)商用槽（微(wei)型槽X，Kibron，芬蘭(lan)）上(shang)測量(liang)的(de)(de)。

數(shu)據分析。最后，我們希望(wang)比較(jiao)不同振(zhen)(zhen)(zhen)動(dong)模(mo)式的(de)(de)(de)(de)光譜振(zhen)(zhen)(zhen)幅(fu)(fu)和線(xian)型(xing)，作為亞相DNA濃度(du)(du)的(de)(de)(de)(de)函數(shu)。由于(yu)VSF是(shi)一(yi)種相干(gan)(gan)光譜，并且我們的(de)(de)(de)(de)數(shu)據包含可能會干(gan)(gan)擾的(de)(de)(de)(de)多個共振(zhen)(zhen)(zhen)，因此(ci)很難通(tong)過(guo)檢查原始數(shu)據來推(tui)斷光譜振(zhen)(zhen)(zhen)幅(fu)(fu)。根據之(zhi)前的(de)(de)(de)(de)作者，我們通(tong)過(guo)將和頻響(xiang)應建模(mo)為洛(luo)倫(lun)茲的(de)(de)(de)(de)集(ji)合，并附加非共振(zhen)(zhen)(zhen)貢(gong)獻（其中(zhong)（2）是(shi)二(er)階磁化率(lv)，Iv是(shi)入射(she)可見光場的(de)(de)(de)(de)強(qiang)度(du)(du)，Iir是(shi)入射(she)紅(hong)外場的(de)(de)(de)(de)強(qiang)度(du)(du)，Anr是(shi)非共振(zhen)(zhen)(zhen)振(zhen)(zhen)(zhen)幅(fu)(fu)，φnr是(shi)非共振(zhen)(zhen)(zhen)相位，An是(shi)振(zhen)(zhen)(zhen)動(dong)模(mo)n的(de)(de)(de)(de)振(zhen)(zhen)(zhen)幅(fu)(fu)，ωn是(shi)振(zhen)(zhen)(zhen)動(dong)模(mo)n的(de)(de)(de)(de)中(zhong)心頻率(lv)，ωir是(shi)紅(hong)外場的(de)(de)(de)(de)頻率(lv)，Γn是(shi)振(zhen)(zhen)(zhen)動(dong)模(mo)n）52的(de)(de)(de)(de)均勻線(xian)寬(kuan)

在下面的(de)內(nei)容中(zhong)(zhong)，我們(men)主要感(gan)興趣(qu)的(de)是比(bi)較(jiao)提(ti)取的(de)光(guang)譜振(zhen)幅(fu)除以線寬：An/Γn。為(wei)了便于與測量(liang)的(de)和(he)頻強(qiang)度(du)進行比(bi)較(jiao)，我們(men)繪(hui)制(zhi)（An/Γn）2。我們(men)通(tong)過使(shi)用等式(shi)1擬(ni)合數(shu)(shu)據并在商用分析和(he)繪(hui)圖(tu)程序(xu)Igor Pro（Wavemetrics，OR）中(zhong)(zhong)實現(xian)Levenberg-Marquardt算法來(lai)提(ti)取這些量(liang)。如下文所述，我們(men)主要感(gan)興趣(qu)的(de)是使(shi)用這種(zhong)數(shu)(shu)據擬(ni)合來(lai)提(ti)取光(guang)譜振(zhen)幅(fu)隨DNA濃度(du)變化的(de)定性趨勢(shi)。因(yin)此，我們(men)沒有嘗試在數(shu)(shu)據分析中(zhong)(zhong)詳盡地探索模型參數(shu)(shu)的(de)相空間(jian)。