2.材料和方法

2.1.材料

主(zhu)要構成重構膜外小葉的脂(zhi)質購自Avanti Polar Lipides（美國阿拉伯斯(si)(si)特市阿拉伯斯(si)(si)特市），并按接收時使用(yong)。化(hua)合物1-棕櫚酰-2-二(er)(er)十二(er)(er)碳六(liu)烯基-sn-甘(gan)油-3-磷酸(suan)膽堿（PC（16:0/22:6），分子量=806.1，純(chun)度(du)>99%）和(he)(he)1-（1Z-十八烷基）-2-二(er)(er)十二(er)(er)碳六(liu)烯基-sn-甘(gan)油-3-磷酸(suan)膽堿PC（P-18:0/22:6，分子量=818.2，純(chun)度(du)>99%）作為(wei)(wei)氯(lv)仿溶(rong)液(ye)（10mg-mL）獲得?1).將(jiang)PC（16:0/22:6）和(he)(he)P-PC（18:0/22:6）的儲備溶(rong)液(ye)稀(xi)釋至1.25 mg mL?1解(jie)決(jue)方(fang)案。以綿羊毛膽固(gu)醇（Chol，Mw=711.0，純(chun)度(du)>98%）和(he)(he)雞蛋(dan)鞘磷脂(zhi)（SM，Mw=386.7，純(chun)度(du)>98%）為(wei)(wei)粉末。二(er)(er)者均以1.25 mg/mL的濃(nong)度(du)溶(rong)解(jie)于氯(lv)仿（HPLC級，法國瓦爾(er)德(de)魯伊爾(er)Carlo Erba）?1.

低(di)溫保護培養基由(you)Trizma堿（173.0 mM）、一(yi)水合檸(ning)檬酸(suan)（70.0 mM）、果糖(tang)（56.0 mM）、甘油（6.4%；v/v）和抗生素(su)(su)（青霉(mei)素(su)(su)G鈉391 mg L）組成?1，硫酸(suan)鏈霉(mei)素(su)(su)856 mg L?1，鹽酸(suan)林可霉(mei)素(su)(su)204 mg L?1，硫酸(suan)大觀霉(mei)素(su)(su)四水合物585 mg L?1）（西格瑪(ma)-奧爾德里(li)奇(qi)，法(fa)國圣昆廷(ting)法(fa)拉維爾）。將pH值調整為(wei)6.2，其滲透壓約(yue)為(wei)1300.0 mOsm。

2.2.低密度脂蛋白的提取

根據Moussa等(deng)(deng)人的(de)方案，從(cong)蛋(dan)(dan)黃中(zhong)(zhong)提(ti)取(qu)低密(mi)(mi)度(du)脂(zhi)(zhi)(zhi)蛋(dan)(dan)白(bai)（LDL）[31]。提(ti)取(qu)后，將低密(mi)(mi)度(du)脂(zhi)(zhi)(zhi)蛋(dan)(dan)白(bai)濃縮提(ti)取(qu)物（22±0.5 g，相當于8.36 g干低密(mi)(mi)度(du)脂(zhi)(zhi)(zhi)蛋(dan)(dan)白(bai)）在低溫保護介質(zhi)（100 mL）中(zhong)(zhong)稀釋。通過micro BCA蛋(dan)(dan)白(bai)質(zhi)分析試(shi)劑盒(he)（Pierce，Thermoscitific，France）對LDL樣(yang)品(pin)中(zhong)(zhong)的(de)蛋(dan)(dan)白(bai)質(zhi)進(jin)行定量，得(de)出8.9±1.0 mg-mL?1.LDL樣(yang)品(pin)中(zhong)(zhong)PC磷脂(zhi)(zhi)(zhi)的(de)含(han)量是根據雞蛋(dan)(dan)中(zhong)(zhong)PC的(de)自然比例（18.4 g PC/100 g干LDL）計(ji)算得(de)出的(de)，Givenbyonton等(deng)(deng)人[33]。它等(deng)(deng)于15.4克(ke)升?1份低密(mi)(mi)度(du)脂(zhi)(zhi)(zhi)蛋(dan)(dan)白(bai)樣(yang)品(pin)。LDL也含(han)有一小部分PE（PC/PE 6:1）[33]。

2.3.精漿收集

從一(yi)頭Prim Holstein公牛身上收集(ji)牛精子，并立即以10000×g離心兩次，以回(hui)收上清液(ye)中的(de)精漿。我們樣(yang)品的(de)蛋白質含量為(wei)88.5±5.0mg-mL?1，由micro BCA蛋白質分(fen)析試(shi)劑盒（Pierce，Thermoscitific，法(fa)國(guo)）測定。

2.4.脂質體的制備

脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)體由(you)(you)冷凍保(bao)護緩(huan)沖液(ye)中(zhong)的(de)卵磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)提取物(wu)(wu)通過(guo)使用Avanti Polar Lipides（美國阿拉巴(ba)馬州(zhou)阿拉巴(ba)馬州(zhou)阿拉巴(ba)馬州(zhou)阿拉巴(ba)馬州(zhou)阿拉巴(ba)馬州(zhou)）的(de)微型擠(ji)出機擠(ji)出而制(zhi)備。卵磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)提取物(wu)(wu)由(you)(you)磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)酰膽(dan)堿（73%）和(he)(he)(he)磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)酰乙醇胺(an)（11%）以及甘油三酯和(he)(he)(he)鞘(qiao)磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)等次要成分(fen)(fen)(fen)組成。提取物(wu)(wu)在(zai)(zai)(zai)低(di)溫保(bao)護緩(huan)沖液(ye)中(zhong)水合過(guo)夜，脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)濃度分(fen)(fen)(fen)別為3.90 mg-mL?1（C1），7.28毫(hao)(hao)克/毫(hao)(hao)升?1（C2），14.56毫(hao)(hao)克/毫(hao)(hao)升?1（C3）和(he)(he)(he)21.84毫(hao)(hao)克/毫(hao)(hao)升?1（C4）。然后在(zai)(zai)(zai)超(chao)聲(sheng)波(bo)浴中(zhong)對(dui)分(fen)(fen)(fen)散(san)液(ye)進(jin)行(xing)15分(fen)(fen)(fen)鐘(zhong)的(de)超(chao)聲(sheng)波(bo)處理（Elmasonic S 30H，來自德國Singen Elma，功(gong)率為275W）。最后，在(zai)(zai)(zai)擠(ji)出機中(zhong)擠(ji)出分(fen)(fen)(fen)散(san)體（20次穿過(guo)100 nm的(de)膜(mo)）。分(fen)(fen)(fen)布尺(chi)寸集(ji)中(zhong)在(zai)(zai)(zai)120nm，Zeta電位值(zhi)為?6毫(hao)(hao)伏。在(zai)(zai)(zai)BSP存在(zai)(zai)(zai)下(xia)引入的(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)體量(liang)以重(zhong)量(liang)表示（脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)體分(fen)(fen)(fen)散(san)體C1、C2、C3和(he)(he)(he)C4分(fen)(fen)(fen)別為1.17 mg、2.18 mg、4.37 mg和(he)(he)(he)6.55 mg的(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)）。不(bu)確定度為0.01 mg。

2.5.電泳

十二烷基(ji)硫(liu)酸鈉-聚(ju)丙烯(xi)酰胺(an)凝膠(jiao)(jiao)(jiao)電泳（SDS-PAGE）在(zai)(zai)還原條(tiao)件下進行。將精漿溶解在(zai)(zai)pH值(zhi)為6.8的緩沖液中，該緩沖液由Tris 0.5 M、SDS 10%、甘油30%w/w和(he)(he)(he)溴(xiu)酚藍(lan)0.4%組成，以(yi)獲(huo)得1mg mL?1解決(jue)方案。添加(jia)9%巰(qiu)基(ji)乙醇v/v，并旋轉(zhuan)樣品(pin)，隨后在(zai)(zai)95°C下加(jia)熱5分鐘。然后，將10μL低范圍分子量(liang)標準品(pin)（試劑盒O6U-0511，來自法國Souffelweyrsheim的Euromedex）和(he)(he)(he)10至25μL精漿裝載在(zai)(zai)15%聚(ju)丙烯(xi)酰胺(an)凝膠(jiao)(jiao)(jiao)（pH 6.8-Tris 0.5 M和(he)(he)(he)SDS 0.10%）上(shang)，并與由Tris 0.025 M、甘氨(an)酸0.192 M和(he)(he)(he)SDS 0.1%組成的pH 8.3遷移緩沖液耦(ou)合。在(zai)(zai)20 mA時進行電泳，并用考馬(ma)斯藍(lan)溶液G250對凝膠(jiao)(jiao)(jiao)進行染(ran)色(se)。最(zui)后對染(ran)色(se)凝膠(jiao)(jiao)(jiao)進行掃(sao)描，并使用Multi-Gauge軟件（2.0版(ban)，日本富士照片(pian)膠(jiao)(jiao)(jiao)片(pian)有限公司）評估峰值(zhi)強度。

2.6.表面活性測量

吉布斯膜(mo)（由(you)精漿(jiang)溶(rong)液(ye)擴散到空(kong)氣-緩沖(chong)界面(mian)形成）的(de)(de)(de)表面(mian)張(zhang)力在安裝在朗繆(mou)爾天(tian)平（Microtoul XL-LB，Kibron Inc.，Helsinki，芬(fen)蘭）上(shang)(shang)的(de)(de)(de)15孔(kong)板（帶(dai)特氟隆邊緣的(de)(de)(de)鋁底多孔(kong)板）上(shang)(shang)測(ce)(ce)量，該天(tian)平配有(you)(you)高靈(ling)敏度(du)傳感器（使用(yong)(yong)合金絲的(de)(de)(de)Wilhelmy方法(fa)）。將該裝置(zhi)置(zhi)于(yu)固定在23°C的(de)(de)(de)溫度(du)控制區內，并用(yong)(yong)純(chun)蒸(zheng)餾(liu)水（美(mei)國密理博公司(si)的(de)(de)(de)Milli-Q系統(tong)）進行校準。測(ce)(ce)量精度(du)為0.1 mN/m。將精漿(jiang)放入第一(yi)個(ge)孔(kong)中，然后在下一(yi)個(ge)孔(kong)中用(yong)(yong)因子2稀釋(shi)，依此類推（每個(ge)孔(kong)的(de)(de)(de)體積為300μL）。每種(zhong)精漿(jiang)提取物重復測(ce)(ce)量4次（n=2）。結果(guo)表示為所有(you)(you)測(ce)(ce)量的(de)(de)(de)平均值。

蛋白質膜的(de)壓(ya)縮等溫(wen)線是在(zai)(zai)之前(qian)配(pei)備(bei)傳感器(qi)的(de)朗(lang)繆爾(er)槽(cao)（MicroTour XL-LB，Kibron Inc.，芬蘭赫(he)爾(er)辛基）上測量的(de)。精漿首先(xian)在(zai)(zai)冷凍保(bao)存緩(huan)(huan)沖液（1/100）中(zhong)稀釋，并在(zai)(zai)緩(huan)(huan)沖液表面逐(zhu)滴（50μL）擴散。平衡20分鐘后，在(zai)(zai)室溫(wen)（23°C）下(xia)記錄壓(ya)縮等溫(wen)線。

2.7.精子膜外小葉脂質結構域的重建

精(jing)(jing)子膜外小葉的(de)(de)(de)脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)結構(gou)域如前所述重建[35]。朗格繆爾(er)(er)槽(cao)（302LL，NIMA技術，英國(guo)(guo)）被插入一個自制的(de)(de)(de)手套箱上，放置在(zai)抗振動(dong)臺(tai)上，用氬氣沖洗，以避免脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)氧化。表面壓(ya)(ya)力的(de)(de)(de)測量精(jing)(jing)度(du)(du)為(wei)0.1 mN/m，使用濾紙制成的(de)(de)(de)一塊極板(ban)（英國(guo)(guo)肯(ken)特郡邁德(de)斯通惠特曼國(guo)(guo)際有限公司生產的(de)(de)(de)無灰惠特曼色譜紙）與電子天(tian)平相(xiang)連。環境溫(wen)度(du)(du)固定(ding)在(zai)20°C。將(jiang)所有燒瓶(ping)和注(zhu)射(she)器(qi)放入手套箱中，然后(hou)用氬氣脫氣1小時，然后(hou)鋪展單(dan)(dan)層(ceng)。朗繆爾(er)(er)天(tian)平的(de)(de)(de)溫(wen)度(du)(du)由(you)設置為(wei)40°C的(de)(de)(de)循環水系(xi)統(tong)進行(xing)恒(heng)溫(wen)控制。緩(huan)沖液(ye)表面的(de)(de)(de)實(shi)際溫(wen)度(du)(du)為(wei)34°C。亞相(xiang)由(you)低溫(wen)保(bao)(bao)護介質(zhi)(zhi)(zhi)組成。將(jiang)膽固醇、鞘磷脂(zhi)、P-PC（18:0/22:6）和PC（16:0/22:6）的(de)(de)(de)氯仿(fang)溶液(ye)以適(shi)當的(de)(de)(de)摩(mo)爾(er)(er)比(bi)（31:14:16:39）用25μL微(wei)型注(zhu)射(she)器(qi)（精(jing)(jing)確(que)到(dao)0.5μL）逐滴涂于緩(huan)沖液(ye)亞相(xiang)上（Hamilton Bonaduz AG，Bonaduz，Switzterland）。單(dan)(dan)層(ceng)保(bao)(bao)持(chi)平衡10分(fen)鐘，然后(hou)以40 cm2/min的(de)(de)(de)屏(ping)障(zhang)速度(du)(du)開始壓(ya)(ya)縮。一旦達到(dao)目(mu)標(biao)(biao)壓(ya)(ya)力（25 mN/m），通過調整(zheng)可移動(dong)屏(ping)障(zhang)的(de)(de)(de)表面積(ji)保(bao)(bao)持(chi)壓(ya)(ya)力恒(heng)定(ding)。由(you)于單(dan)(dan)分(fen)子層(ceng)在(zai)30 mN/m時不夠穩(wen)定(ding)，這是(shi)與雙層(ceng)中脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)堆積(ji)密度(du)(du)相(xiang)關(guan)的(de)(de)(de)膜壓(ya)(ya)力[36]，我(wo)們將(jiang)目(mu)標(biao)(biao)壓(ya)(ya)力降低到(dao)25 mN/m，其中單(dan)(dan)分(fen)子層(ceng)更穩(wen)定(ding)（見結果）。

一旦達(da)到目(mu)標壓力（25 mN/m），將其保(bao)持1000 s，然后使用(yong)彎曲針(zhen)管將生(sheng)物(wu)(wu)分子(zi)（LDL、BSP或(huo)脂(zhi)質體）溶(rong)(rong)液(ye)引(yin)入(ru)亞(ya)相(xiang)(xiang)。針(zhen)頭彎曲遠離針(zhen)尖(jian)，并位于(yu)槽的(de)底部，以(yi)便在(zai)壓縮的(de)亞(ya)相(xiang)(xiang)下(xia)方(fang)進(jin)行注射(she)。之前(qian)將當量體積(ji)(ji)(ji)(ji)（每種(zhong)添加劑0.3 mL）移到屏障后面(mian)。注射(she)生(sheng)物(wu)(wu)分子(zi)后，監測(ce)每個(ge)脂(zhi)質分子(zi)的(de)面(mian)積(ji)(ji)(ji)(ji)變化，并表(biao)(biao)(biao)示為相(xiang)(xiang)對于(yu)初始值(zhi)的(de)變化（a/a=（a?A（t0）×100/A（t0）。它(ta)已(yi)經被跟蹤(zong)了3000秒，相(xiang)(xiang)當于(yu)冷凍保(bao)存前(qian)處理精(jing)液(ye)的(de)時間。在(zai)這種(zhong)恒(heng)壓模式下(xia)，生(sheng)物(wu)(wu)分子(zi)插入(ru)脂(zhi)質單層導(dao)致膜壓力增加，而膜壓力通過增加表(biao)(biao)(biao)面(mian)積(ji)(ji)(ji)(ji)而降低。相(xiang)(xiang)反(fan)，如果生(sheng)物(wu)(wu)分子(zi)導(dao)致脂(zhi)質單層溶(rong)(rong)解在(zai)亞(ya)相(xiang)(xiang)中(zhong)，則表(biao)(biao)(biao)面(mian)積(ji)(ji)(ji)(ji)減(jian)小。重復所有數據，偏差不(bu)超過表(biao)(biao)(biao)面(mian)積(ji)(ji)(ji)(ji)的(de)5%。

2.8.低溫透射電子顯微鏡（Cryo TEM）

使(shi)用(yong)低(di)溫插(cha)入式低(di)溫固定(ding)裝(zhuang)置（美(mei)國加坦）制備(bei)用(yong)于低(di)溫TEM觀(guan)察的(de)試(shi)樣(yang)，其中(zhong)一滴水(shui)懸浮液(ye)沉(chen)積在(zai)輝光(guang)放電多孔(kong)型(xing)碳(tan)(tan)涂層(ceng)格(ge)柵（美(mei)國Ted Pella公(gong)司(si)）上。然(ran)后，通(tong)過(guo)將含有試(shi)樣(yang)的(de)液(ye)滴吸干到支撐碳(tan)(tan)膜孔(kong)上殘留的(de)薄層(ceng)液(ye)體上，制備(bei)TEM網格(ge)。通(tong)過(guo)將格(ge)柵快(kuai)速插(cha)入液(ye)氮(dan)冷卻的(de)液(ye)態乙(yi)烷(wan)中(zhong)，使(shi)液(ye)膜玻(bo)(bo)璃化。玻(bo)(bo)璃化標(biao)(biao)本安裝(zhuang)在(zai)Gatan 910標(biao)(biao)本架(jia)（美(mei)國Gatan）中(zhong)，使(shi)用(yong)CT-3500-cryotransfer系(xi)統（美(mei)國Gatan）將其插(cha)入顯微(wei)鏡中(zhong)，并用(yong)液(ye)氮(dan)冷卻。然(ran)后從保存在(zai)玻(bo)(bo)璃質冰中(zhong)并懸浮在(zai)支撐碳(tan)(tan)基質上的(de)孔(kong)中(zhong)的(de)標(biao)(biao)本獲得TEM圖像。

在(zai)低劑量條件(jian)下觀(guan)察(cha)樣品（<10 e?/A2），在(zai)?178°C，使用JEM 1230“Cryo”顯微(wei)鏡（日本Jeol），在(zai)80 kV下運(yun)行(xing)，并配備LaB6燈(deng)絲。所有顯微(wei)照片均記錄在(zai)Gatan 1.35K×1.04K×12位ES500W CCD相機上(shang)。為(wei)確保觀(guan)察(cha)的良好重復性，從(cong)幾(ji)個樣品制備中采集了一系列超過50張的圖像，放大率不同。