摘要

底(di)物特異(yi)性(xing)是(shi)(shi)表(biao)征酶的(de)一個關鍵參數，它直接(jie)關系到(dao)酶的(de)應用(yong)潛力。商(shang)品化的(de)Lecitase Ultra已被(bei)廣(guang)泛用(yong)于石(shi)油(you)脫膠過程中(zhong)，以(yi)特異(yi)性(xing)水解(jie)原油(you)中(zhong)的(de)磷脂(zhi)(zhi)(zhi)，但其對(dui)(dui)各(ge)(ge)種(zhong)(zhong)磷脂(zhi)(zhi)(zhi)的(de)特異(yi)性(xing)仍(reng)不(bu)清楚。在本研(yan)究(jiu)中(zhong)，采用(yong)單層技術，在不(bu)同的(de)表(biao)面(mian)壓力條(tiao)件下表(biao)征了(le)(le)超乳(ru)糖酸酶對(dui)(dui)不(bu)同種(zhong)(zhong)類磷脂(zhi)(zhi)(zhi)的(de)選擇(ze)性(xing)。超乳(ru)糖酸酶對(dui)(dui)各(ge)(ge)種(zhong)(zhong)磷脂(zhi)(zhi)(zhi)的(de)水解(jie)活性(xing)高度依賴于單層膜(mo)的(de)表(biao)面(mian)壓力。在相同的(de)表(biao)面(mian)壓力（25mN/m）下，在所有磷脂(zhi)(zhi)(zhi)單層膜(mo)的(de)液體冷凝狀態(tai)下，超卵磷脂(zhi)(zhi)(zhi)酶對(dui)(dui)不(bu)同單分子磷脂(zhi)(zhi)(zhi)膜(mo)的(de)偏好(hao)順序為(wei)PE>CL>PS>PI>PC。在測試的(de)表(biao)面(mian)壓力范圍內，未(wei)觀(guan)察到(dao)鞘磷脂(zhi)(zhi)(zhi)的(de)水解(jie)活性(xing)。目(mu)前的(de)研(yan)究(jiu)提供(gong)了(le)(le)關于Lecitase Ultra對(dui)(dui)各(ge)(ge)種(zhong)(zhong)磷脂(zhi)(zhi)(zhi)的(de)選擇(ze)性(xing)偏好(hao)順序的(de)基本信息，這是(shi)(shi)以(yi)前未(wei)知(zhi)的(de)，并為(wei)更好(hao)地(di)利用(yong)這種(zhong)(zhong)酶在石(shi)油(you)工(gong)業中(zhong)提供(gong)了(le)(le)額外的(de)信息。

實際應用

據我們(men)(men)所知，我們(men)(men)已經報道了應(ying)用單層(ceng)技術研究超乳糖酸(suan)酶(mei)對(dui)各種天然磷脂的(de)底(di)物(wu)選擇性。這項(xiang)研究直接有(you)助于(yu)該酶(mei)在工(gong)業中的(de)應(ying)用。此外，我們(men)(men)試(shi)圖證明(ming)單層(ceng)技術對(dui)于(yu)評估(gu)某些(xie)天然底(di)物(wu)的(de)酶(mei)活(huo)性是非常有(you)效和簡單的(de)，并且應(ying)該在界面酶(mei)工(gong)程(cheng)領(ling)域做出更大的(de)貢獻(xian)。

圖形摘要

利用單層技(ji)術表(biao)征(zheng)超乳糖酸酶對不同磷脂的界面催化性能(neng)。

1、介紹

 Lecitase Ultra是藍綠假單胞菌(jun)脂(zhi)肪酶（TLL）和尖(jian)孢鐮刀菌(jun)脂(zhi)肪酶（FOL）的(de)嵌合(he)體[1]，具有相當高的(de)磷(lin)脂(zhi)酶活性和脂(zhi)肪酶活性[2]。這種酶完(wan)全基于其(qi)磷(lin)脂(zhi)酶活性，能夠水解油(you)(you)中(zhong)的(de)磷(lin)脂(zhi)，并通(tong)過形成溶血磷(lin)脂(zhi)和甘油(you)(you)磷(lin)脂(zhi)將其(qi)去除，從而(er)成功地用于植物油(you)(you)的(de)脫膠[3,4]。正如(ru)我們所(suo)知，不(bu)同來(lai)(lai)源(yuan)的(de)原油(you)(you)中(zhong)磷(lin)脂(zhi)的(de)組成和含量(liang)存在顯(xian)著差異：例如(ru)，原油(you)(you)中(zhong)的(de)卵磷(lin)脂(zhi)通(tong)常含有20%的(de)磷(lin)脂(zhi)酰(xian)膽堿（PC）、15%的(de)磷(lin)脂(zhi)酰(xian)乙醇胺（PE）、20%的(de)磷(lin)脂(zhi)酰(xian)肌(ji)醇（PI）、5%的(de)磷(lin)脂(zhi)酸(suan)（PA）和其(qi)他磷(lin)脂(zhi)[5]。因此，Lecitase Ultra對(dui)不(bu)同磷(lin)脂(zhi)的(de)選擇性是實(shi)際應(ying)用中(zhong)的(de)一個重(zhong)要(yao)參考指(zhi)標(biao)，這反過來(lai)(lai)又與應(ying)添加的(de)酶量(liang)以及脫膠過程(cheng)中(zhong)所(suo)需的(de)反應(ying)時(shi)間直(zhi)接(jie)相關。因此，獲得(de)這種酶對(dui)天(tian)然(ran)磷(lin)脂(zhi)的(de)選擇性信息尤為重(zhong)要(yao)。然(ran)而(er)，仍然(ran)缺(que)乏(fa)對(dui)這方面的(de)深入了解。

脂(zhi)肪(fang)酶(mei)作為一種(zhong)界(jie)面(mian)(mian)酶(mei)，催化(hua)(hua)不溶(rong)性底物與水之間(jian)的界(jie)面(mian)(mian)水解(jie)反(fan)應[6]。因此，脂(zhi)肪(fang)分解(jie)的催化(hua)(hua)反(fan)應與各種(zhong)界(jie)面(mian)(mian)現象(xiang)有(you)(you)關，并強烈依(yi)賴于界(jie)面(mian)(mian)上存在(zai)的脂(zhi)質基質的結構組織[6-8]。為了獲得有(you)(you)關酶(mei)對(dui)各種(zhong)磷脂(zhi)選(xuan)擇(ze)性的適當信息，選(xuan)擇(ze)合適的測試(shi)方(fang)法至(zhi)關重要(yao)，應該(gai)是(shi)首要(yao)考慮(lv)的問題。

單(dan)層技術是研(yan)究(jiu)空(kong)氣(qi)/水界面上酶(mei)(mei)(mei)(mei)-脂質相互作用的(de)(de)(de)(de)最(zui)通用的(de)(de)(de)(de)實(shi)驗系統，已被用于通過相對表(biao)面活性(xing)來(lai)比較脂肪酶(mei)(mei)(mei)(mei)的(de)(de)(de)(de)底物選擇性(xing)[9]。使用單(dan)層技術進(jin)行酶(mei)(mei)(mei)(mei)表(biao)征(zheng)有幾個優點。首先，底物和(he)酶(mei)(mei)(mei)(mei)只需要少量的(de)(de)(de)(de)物質。因此，我(wo)們可(ke)以以非(fei)常(chang)低的(de)(de)(de)(de)成(cheng)本獲得酶(mei)(mei)(mei)(mei)的(de)(de)(de)(de)活性(xing)信(xin)息。其(qi)次，可(ke)以改變表(biao)面組分(fen)(fen)的(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)子堆積，并且(qie)可(ke)以連續監測脂質或蛋白(bai)質從界面的(de)(de)(de)(de)釋放或轉(zhuan)移到(dao)界面的(de)(de)(de)(de)情況。第三(san)，與傳(chuan)統的(de)(de)(de)(de)pH-stat方法(fa)相比，該(gai)方法(fa)的(de)(de)(de)(de)高靈敏度(du)已通過實(shi)驗得到(dao)驗證(zheng)[10,11]。最(zui)后，反(fan)應的(de)(de)(de)(de)物理化學參數(shu)，如溫度(du)、側壓、分(fen)(fen)子密度(du)、離子條件等，可(ke)以在很寬的(de)(de)(de)(de)范圍內方便(bian)地改變，并且(qie)可(ke)以以?精度(du)分(fen)(fen)析(xi)結(jie)構[12]。因此，單(dan)分(fen)(fen)子層是研(yan)究(jiu)界面酶(mei)(mei)(mei)(mei)反(fan)應的(de)(de)(de)(de)合適(shi)模型(xing)。到(dao)目前為止，不同種(zhong)類的(de)(de)(de)(de)脂肪酶(mei)(mei)(mei)(mei)，甚(shen)至磷(lin)脂酶(mei)(mei)(mei)(mei)（包括磷(lin)脂酶(mei)(mei)(mei)(mei)A2、C和(he)D）已經通過使用這種(zhong)方法(fa)進(jin)行了(le)表(biao)征(zheng)[11-14]。

本文首次采(cai)用(yong)單層技術對商品化超(chao)乳糖酸酶的(de)底(di)物選(xuan)擇性(xing)進行了表征。目前的(de)結果不(bu)僅提(ti)供了對酶底(di)物選(xuan)擇性(xing)的(de)透徹理解，而(er)且為酶在石油工業中的(de)具體用(yong)途提(ti)供了詳細(xi)信息。

2、材料和方法

2.1材料

商業(ye)Lecitase Ultra由丹(dan)麥巴格(ge)斯瓦爾(er)德(de)諾維信A/S提供，直接(jie)測試，無需進一步純(chun)(chun)(chun)化。L-α-磷(lin)脂酰(xian)肌醇（PI，純(chun)(chun)(chun)度(du)≥1,2-二(er)酰(xian)基-sn-甘油(you)-3-磷(lin)酸-L-絲氨酸（PS，純(chun)(chun)(chun)度(du)≥97%），L-α-磷(lin)脂酰(xian)乙醇胺（PE，純(chun)(chun)(chun)度(du)≥1,2-二(er)油(you)基-sn-甘油(you)-3-磷(lin)酸膽堿（PC，純(chun)(chun)(chun)度(du)≥97%），心磷(lin)脂（CL，純(chun)(chun)(chun)度(du)）≥鞘磷(lin)脂（SM，純(chun)(chun)(chun)度(du)）≥98%）和β-環糊精從(cong)Sigma-Aldrich（密蘇里州圣路易斯）購買(mai)。HPLC級氯(lv)仿(fang)購自凱美(mei)爾(er)化學(xue)試劑有(you)限公司（天津）。使用Millipore（馬薩諸(zhu)塞州貝德(de)福(fu)德(de)）Milli-Q水(shui)系統凈化水(shui)。所有(you)其他攝(she)政王都是分析級的。

2.2單分子薄膜實驗

2.2.1表面壓力-面積等溫線

使用帶(dai)有Langmuir-Teflon槽(cao)（206 mm×59 mm）的(de)商(shang)用單層系(xi)統（芬(fen)蘭赫爾辛基(ji)Kibron的(de)微槽(cao)X）和兩個屏障的(de)對稱壓(ya)(ya)縮(suo)，記錄不同磷(lin)脂單層的(de)壓(ya)(ya)縮(suo)等(deng)溫(wen)線。實(shi)驗在(zai)室溫(wen)（25℃）下進行。通過使用microsyringe（Hamilton Co.，Reno，NV）將不同磷(lin)脂的(de)氯仿(fang)儲備溶液(ye)滴(di)在(zai)50 mM檸(ning)檬(meng)酸緩沖液(ye)（pH 5.0）亞相上(shang)形成單層（Hamilton Co.，Reno，NV）。15分鐘后，以2.5 mm/min的(de)速率連續壓(ya)(ya)縮(suo)所需組(zu)合物的(de)單層。表(biao)(biao)面壓(ya)(ya)力是用附(fu)著在(zai)表(biao)(biao)面的(de)金屬絲探針(zhen)測量的(de)。連續記錄表(biao)(biao)面壓(ya)(ya)力與(yu)表(biao)(biao)面積(ji)（π-A）等(deng)溫(wen)線。只(zhi)要(yao)(yao)需要(yao)(yao)，膠片(pian)就被壓(ya)(ya)縮(suo)到(dao)崩(beng)潰(kui)壓(ya)(ya)力。每次運行重復三次，保(bao)持π-A等(deng)溫(wen)線的(de)標準偏(pian)差(cha)小于4?2。

2.2.2使用(yong)一個(ge)(ge)(ge)"零級(ji)"槽(cao)（由一個(ge)(ge)(ge)圓形反(fan)應(ying)(ying)(ying)室(shi)(shi)和(he)兩(liang)個(ge)(ge)(ge)儲(chu)(chu)液(ye)(ye)室(shi)(shi)（182mm×40mm）組成(cheng)）進(jin)行了Lecitase Ultra的(de)(de)(de)動(dong)(dong)力(li)(li)學水(shui)解(jie)(jie)活(huo)性(xing)計(ji)算。反(fan)應(ying)(ying)(ying)室(shi)(shi)的(de)(de)(de)直徑為21 mm，面(mian)積(ji)為346 mm2。這(zhe)兩(liang)種隔(ge)室(shi)(shi)通(tong)過一個(ge)(ge)(ge)小的(de)(de)(de)表面(mian)通(tong)道(dao)（寬(kuan)0.5厘米(mi)）相(xiang)(xiang)(xiang)互連接。該方法的(de)(de)(de)原理之前由Verger和(he)De Haas[15]描(miao)述。在(zai)(zai)目前的(de)(de)(de)工作中，用(yong)毫(hao)Q水(shui)制備(bei)(bei)50 mM檸(ning)(ning)檬酸緩沖液(ye)(ye)（pH 5.0），并通(tong)過0.45μm微孔(kong)膜過濾。在(zai)(zai)50 mM檸(ning)(ning)檬酸緩沖液(ye)(ye)（pH 5.0）亞相(xiang)(xiang)(xiang)上(shang)(shang)涂抹幾微升(sheng)氯仿磷脂溶液(ye)(ye)，直到達到所需的(de)(de)(de)初始表面(mian)壓(ya)力(li)(li)（πi），制備(bei)(bei)單層。由恒壓(ya)器(qi)自動(dong)(dong)驅動(dong)(dong)的(de)(de)(de)移(yi)動(dong)(dong)式屏障在(zai)(zai)儲(chu)(chu)層上(shang)(shang)來回(hui)移(yi)動(dong)(dong)，以壓(ya)縮并保(bao)持表面(mian)壓(ya)力(li)(li)（π）恒定。為了確保(bao)水(shui)解(jie)(jie)反(fan)應(ying)(ying)(ying)中產(chan)生的(de)(de)(de)長鏈(lian)脂肪(fang)酸能夠溶解(jie)(jie)在(zai)(zai)水(shui)中，按照Mosbah等人的(de)(de)(de)建議(yi)，將β-環糊精（0.6 mg/ml）注入(ru)反(fan)應(ying)(ying)(ying)室(shi)(shi)。[10]。然后將10μL酶溶液(ye)(ye)注入(ru)反(fan)應(ying)(ying)(ying)室(shi)(shi)的(de)(de)(de)亞相(xiang)(xiang)(xiang)以開始反(fan)應(ying)(ying)(ying)。如前所述，對數據(ju)進(jin)行了相(xiang)(xiang)(xiang)應(ying)(ying)(ying)的(de)(de)(de)分析[15,16]。活(huo)性(xing)顯示(shi)為單位(wei)時間(jian)、單位(wei)反(fan)應(ying)(ying)(ying)室(shi)(shi)面(mian)積(ji)和(he)"零級(ji)"槽(cao)中每毫(hao)升(sheng)酶水(shui)解(jie)(jie)的(de)(de)(de)底物摩(mo)爾(er)數（摩(mo)爾(er)數cm-2.min-1.mL-1）。所有分析測定均一式三份進(jin)行。結果以平均標準(zhun)偏(pian)差（SD）的(de)(de)(de)形式清楚地呈現。