3.結果

3.1.體外抗癌能力和選擇性

G（IIKK）nI-NH2（n?1e4）肽是通過Fmoc固(gu)相(xiang)肽合成協議[9e11]合成的(de)(de)。CD研(yan)究表明，這(zhe)些(xie)肽主要存在于緩沖溶液中的(de)(de)無(wu)序(xu)結(jie)構中。在添加到(dao)DPPG（二棕(zong)櫚酰磷脂酰甘油）SUV（模擬(ni)帶負電荷的(de)(de)細(xi)菌和癌細(xi)胞(bao)膜的(de)(de)小單層囊泡）中后(hou)，除(chu)了GIIKKI-NH2外，肽采用a-螺旋構象(xiang)。兩(liang)親(qin)螺旋結(jie)構有利于它們與脂質雙層的(de)(de)相(xiang)互作用，但GIIKKI-NH2始終保持未(wei)折(zhe)疊狀態，無(wu)論周(zhou)圍環境發生任何變化。二級結(jie)構的(de)(de)這(zhe)種缺(que)乏(fa)變化與其缺(que)乏(fa)生物(wu)活性很好(hao)地一致。隨后(hou)的(de)(de)細(xi)胞(bao)研(yan)究集(ji)中于n?2、3和4的(de)(de)系列。

按照濃度依賴性(xing)(xing)模式，重復次數較多或長(chang)度較長(chang)的(de)(de)(de)(de)肽(tai)在(zai)殺(sha)死癌細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)（HeLa和HL60細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)）方面更有效(xiao)(xiao)，但對(dui)(dui)正(zheng)常細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)（紅細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)和HDFa細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)）的(de)(de)(de)(de)體外(wai)毒性(xing)(xing)也開始增加，如(ru)圖(tu)1aec所示(shi)。總(zong)的(de)(de)(de)(de)來說，就體外(wai)抗(kang)癌活性(xing)(xing)和細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)選擇性(xing)(xing)而言(yan)，G（IIKK）3I-NH2是最佳序列，其對(dui)(dui)HeLa和HL60細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)IC50值為15和25 mM，EC50遠大于250 mM（IC50：濃度導致50%的(de)(de)(de)(de)癌細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)生長(chang)抑制；EC50：濃度誘(you)導50%的(de)(de)(de)(de)紅細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)溶解）。重要(yao)的(de)(de)(de)(de)是，HDFa細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)對(dui)(dui)這(zhe)些(xie)肽(tai)有良好的(de)(de)(de)(de)耐受(shou)性(xing)(xing)，例如(ru)，在(zai)濃度低(di)于50 mM時，G（IIKK）3I-NH2對(dui)(dui)HDFa細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)影響微不足道（圖(tu)1c）。我們(men)合理設計的(de)(de)(de)(de)短肽(tai)的(de)(de)(de)(de)這(zhe)種性(xing)(xing)能明顯優于天然AMP，如(ru)馬蓋寧和蜂毒素，并且(qie)在(zai)有效(xiao)(xiao)性(xing)(xing)、選擇性(xing)(xing)甚至(zhi)耐藥(yao)性(xing)(xing)方面也優于抗(kang)癌藥(yao)物順鉑[12e15]。例如(ru)，在(zai)類似的(de)(de)(de)(de)實驗條件下，magainin-2對(dui)(dui)HeLa細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)IC50低(di)于60 mM，而蜂毒肽(tai)在(zai)5 mM下的(de)(de)(de)(de)EC50則(ze)低(di)得多，顯示(shi)出對(dui)(dui)宿主細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)高毒性(xing)(xing)[12e14]。

圖(tu)1。設計的a-螺(luo)旋肽(tai)的細(xi)(xi)胞(bao)毒性(xing)(xing)和(he)選擇(ze)性(xing)(xing)。（a）對(dui)HeLa和(he)HL60細(xi)(xi)胞(bao)的細(xi)(xi)胞(bao)毒性(xing)(xing)。（b）人類紅(hong)細(xi)(xi)胞(bao)溶血。（c）對(dui)HDFa細(xi)(xi)胞(bao)的細(xi)(xi)胞(bao)毒性(xing)(xing)。（d）FITC-G（IIKK）3I-NH2在含有(you)HL60癌(ai)細(xi)(xi)胞(bao)和(he)HDFa原代細(xi)(xi)胞(bao)的體外共培(pei)養系統中的分布。

然后(hou)，我們進一步評估了基于體外共培養(yang)系(xi)(xi)統的(de)細(xi)(xi)(xi)胞選擇性，該(gai)系(xi)(xi)統包(bao)含HL60癌(ai)細(xi)(xi)(xi)胞和HDFa原代細(xi)(xi)(xi)胞，它們與體內環境非常相似(si)[8]。將最終(zhong)濃度為20 mM的(de)FITC-G（IIKK）3I-NH2添(tian)加到(dao)系(xi)(xi)統中(zhong)，培養(yang)1 h后(hou)，用熒光顯(xian)(xian)微鏡(jing)觀察兩(liang)種(zhong)細(xi)(xi)(xi)胞中(zhong)的(de)肽分布（圖(tu)1d）。很明顯(xian)(xian)，綠色熒光集中(zhong)在懸浮和圓(yuan)形HL60細(xi)(xi)(xi)胞中(zhong)，而不是(shi)粘附和紡錘(chui)形HDFa細(xi)(xi)(xi)胞中(zhong)，這再次表明肽具有良好(hao)的(de)細(xi)(xi)(xi)胞選擇性，以及對癌(ai)細(xi)(xi)(xi)胞的(de)快速識別。

3.2.肽與脂質單層的選擇性相互作用

在這(zhe)個階(jie)段，這(zhe)些肽(tai)(tai)的(de)(de)(de)選擇(ze)性(xing)(xing)(xing)背后的(de)(de)(de)機制過程在很(hen)大程度上仍(reng)不(bu)清(qing)楚，但抗(kang)癌(ai)肽(tai)(tai)主要是膜(mo)(mo)(mo)活性(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)，它(ta)們(men)對(dui)癌(ai)細胞(bao)的(de)(de)(de)作用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)方式(shi)涉及膜(mo)(mo)(mo)破壞(huai)。此(ci)外(wai)(wai)(wai)，它(ta)們(men)對(dui)癌(ai)細胞(bao)的(de)(de)(de)選擇(ze)性(xing)(xing)(xing)殺(sha)傷與(yu)(yu)(yu)癌(ai)細胞(bao)的(de)(de)(de)兩(liang)個關鍵細胞(bao)膜(mo)(mo)(mo)特征密(mi)切相(xiang)關，即(ji)凈(jing)負(fu)表面(mian)(mian)電(dian)荷(he)和(he)(he)(he)更大的(de)(de)(de)膜(mo)(mo)(mo)流動(dong)性(xing)(xing)(xing)[2,3,16]。為(wei)(wei)(wei)了(le)(le)了(le)(le)解肽(tai)(tai)和(he)(he)(he)細胞(bao)膜(mo)(mo)(mo)之(zhi)間的(de)(de)(de)特殊(shu)相(xiang)互(hu)作用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)以及分子(zi)水平上抗(kang)癌(ai)作用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)的(de)(de)(de)基本過程，我們(men)轉向使用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)脂質(zhi)單層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)的(de)(de)(de)膜(mo)(mo)(mo)模型。圖(tu)(tu)2a顯(xian)示了(le)(le)在最終濃度為(wei)(wei)(wei)3 mM的(de)(de)(de)條(tiao)件下，將(jiang)G（IIKK）（2e4）I-NH2注(zhu)入(ru)亞相(xiang)時，DPPC（二棕櫚酰(xian)磷脂酰(xian)膽堿）和(he)(he)(he)DPPG單層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)（分別模擬正常哺乳動(dong)物(wu)宿主細胞(bao)和(he)(he)(he)癌(ai)細胞(bao)外(wai)(wai)(wai)膜(mo)(mo)(mo)）的(de)(de)(de)表面(mian)(mian)壓(ya)力(li)從不(bu)同的(de)(de)(de)初始表面(mian)(mian)壓(ya)力(li)（pi）增(zeng)加(jia)（Dp），同時保持表面(mian)(mian)積不(bu)變。所有(you)的(de)(de)(de)肽(tai)(tai)都表現出(chu)對(dui)帶(dai)負(fu)電(dian)荷(he)的(de)(de)(de)DPPG單層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)的(de)(de)(de)明顯(xian)偏(pian)好，而對(dui)兩(liang)性(xing)(xing)(xing)離(li)(li)子(zi)DPPC單層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)的(de)(de)(de)親和(he)(he)(he)力(li)則要小得(de)多。在Dp?0處對(dui)每個壓(ya)力(li)圖(tu)(tu)進(jin)(jin)行外(wai)(wai)(wai)推，得(de)出(chu)排(pai)(pai)除(chu)壓(ya)力(li)，超過該壓(ya)力(li)，肽(tai)(tai)不(bu)再能夠穿透脂質(zhi)單層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)，從而導致表面(mian)(mian)壓(ya)力(li)進(jin)(jin)一(yi)(yi)步增(zeng)加(jia)。對(dui)于兩(liang)性(xing)(xing)(xing)離(li)(li)子(zi)DPPC單層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)，G（IIKK）2I-NH2的(de)(de)(de)排(pai)(pai)斥(chi)壓(ya)力(li)為(wei)(wei)(wei)23.4 mN/m，遠低于生(sheng)(sheng)物(wu)膜(mo)(mo)(mo)的(de)(de)(de)30e35 mN/m生(sheng)(sheng)理范圍[17,18]，這(zhe)與(yu)(yu)(yu)其對(dui)紅細胞(bao)的(de)(de)(de)毒性(xing)(xing)(xing)很(hen)小相(xiang)符。相(xiang)比之(zhi)下，G（IIKK）（3e4）I-NH2的(de)(de)(de)值(zhi)分別增(zeng)加(jia)到32.0和(he)(he)(he)37.6 mN/m，這(zhe)與(yu)(yu)(yu)它(ta)們(men)的(de)(de)(de)溶血活性(xing)(xing)(xing)增(zeng)加(jia)一(yi)(yi)致。另一(yi)(yi)方面(mian)(mian)，對(dui)于帶(dai)負(fu)電(dian)荷(he)的(de)(de)(de)DPPG單層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)，排(pai)(pai)斥(chi)壓(ya)力(li)分別顯(xian)著增(zeng)加(jia)至37.3、40.6和(he)(he)(he)42.6 mN/m，表明陽離(li)(li)子(zi)肽(tai)(tai)電(dian)荷(he)和(he)(he)(he)陰離(li)(li)子(zi)脂質(zhi)頭基團之(zhi)間的(de)(de)(de)靜電(dian)相(xiang)互(hu)作用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)起著關鍵作用(yong)(yong)(yong)(yong)(yong)。盡(jin)管(guan)DPPC和(he)(he)(he)DPPG單分子(zi)膜(mo)(mo)(mo)對(dui)G（IIKK）2I-NH2的(de)(de)(de)排(pai)(pai)斥(chi)壓(ya)差較大（參見補(bu)充(chong)數據，圖(tu)(tu)S1），但其對(dui)后者的(de)(de)(de)排(pai)(pai)斥(chi)壓(ya)僅(jin)略(lve)高(gao)于生(sheng)(sheng)物(wu)膜(mo)(mo)(mo)30e 35 mN/m的(de)(de)(de)生(sheng)(sheng)理范圍，這(zhe)與(yu)(yu)(yu)其殺(sha)死癌(ai)細胞(bao)的(de)(de)(de)效率(lv)較低一(yi)(yi)致，因(yin)此(ci)，這(zhe)種(zhong)肽(tai)(tai)在癌(ai)癥治療中(zhong)沒有(you)吸引(yin)力(li)。另一(yi)(yi)方面(mian)(mian)，G（IIKK）4I-NH2對(dui)兩(liang)性(xing)(xing)(xing)離(li)(li)子(zi)DPPC單分子(zi)膜(mo)(mo)(mo)的(de)(de)(de)排(pai)(pai)斥(chi)壓(ya)力(li)為(wei)(wei)(wei)37.6 mN/m，略(lve)高(gao)于30e35 mN/m的(de)(de)(de)生(sheng)(sheng)理范圍，這(zhe)與(yu)(yu)(yu)該系列中(zhong)表現出(chu)的(de)(de)(de)最高(gao)溶血能力(li)一(yi)(yi)致。G（IIKK）3I-NH2顯(xian)示出(chu)中(zhong)間值(zhi)，DPPC單層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)的(de)(de)(de)Dp值(zhi)為(wei)(wei)(wei)32.0 mN/m，DPPG單層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)的(de)(de)(de)Dp值(zhi)為(wei)(wei)(wei)40.6 mN/m，這(zhe)與(yu)(yu)(yu)體外(wai)(wai)(wai)細胞(bao)工作中(zhong)的(de)(de)(de)最佳細胞(bao)選擇(ze)性(xing)(xing)(xing)一(yi)(yi)致。

圖2。肽(tai)與(yu)不(bu)同脂質單層的(de)(de)相互作用(yong)。（a）當肽(tai)以3 mM濃度注入亞相時，在(zai)不(bu)同初始表面(mian)壓力(li)（pi）下，DPPC和DPPG單分(fen)子膜的(de)(de)表面(mian)壓力(li)增加（Dp）。（b）將G（IIKK）3I-NH2注入DPPC和POPC單分(fen)子膜的(de)(de)亞相后(hou)的(de)(de)表面(mian)壓力(li)與(yu)時間的(de)(de)關系。

癌細胞中膽(dan)固醇水平的(de)降低和(he)(he)(he)(he)(he)具有(you)不(bu)飽和(he)(he)(he)(he)(he)脂肪(fang)酰(xian)(xian)鏈的(de)脂質的(de)增(zeng)(zeng)(zeng)加可(ke)能(neng)是膜(mo)(mo)流動(dong)性增(zeng)(zeng)(zeng)加的(de)原因(yin)[19]。將(jiang)最終(zhong)濃度為(wei)3 mM的(de)G（IIKK）3I-NH2注入亞相后(hou)，飽和(he)(he)(he)(he)(he)DPPC和(he)(he)(he)(he)(he)不(bu)飽和(he)(he)(he)(he)(he)棕櫚酰(xian)(xian)油(you)酰(xian)(xian)磷酰(xian)(xian)膽(dan)堿（POPC）單分(fen)子膜(mo)(mo)的(de)平衡表(biao)(biao)面壓(ya)(ya)力(li)增(zeng)(zeng)(zeng)加趨(qu)于3.5和(he)(he)(he)(he)(he)10 mN/m，初始表(biao)(biao)面壓(ya)(ya)力(li)為(wei)30 mN/m（圖(tu)2b），表(biao)(biao)明無論(lun)膜(mo)(mo)電荷相互作(zuo)用如何(he)，增(zeng)(zeng)(zeng)加的(de)膜(mo)(mo)流動(dong)性確實(shi)有(you)利于表(biao)(biao)面活性肽的(de)膜(mo)(mo)滲透。

3.3.肽的原位定位和質膜完整性

為了在與(yu)HeLa細(xi)(xi)胞(bao)孵育(yu)期(qi)間(jian)精(jing)確(que)定位抗(kang)癌肽(tai)(tai)，使(shi)用(yong)濃(nong)度為10 mM的(de)FITC-G（IIKK）3I-NH2，并使(shi)用(yong)激(ji)光共(gong)聚焦顯微鏡觀察其在這些細(xi)(xi)胞(bao)中的(de)熒光分(fen)布(bu)，與(yu)孵育(yu)時間(jian)有(you)關。孵育(yu)1小(xiao)時后(hou)，大部分(fen)FITC衍生信(xin)(xin)號（綠(lv)色（網絡版））位于HeLa細(xi)(xi)胞(bao)膜(mo)(mo)上，在細(xi)(xi)胞(bao)質(zhi)內觀察到相(xiang)對較弱的(de)熒光信(xin)(xin)號（圖(tu)3a），表明(ming)細(xi)(xi)胞(bao)周圍的(de)膜(mo)(mo)是(shi)這一時期(qi)的(de)主要靶(ba)點。然而，孵育(yu)24小(xiao)時后(hou)，熒光信(xin)(xin)號在細(xi)(xi)胞(bao)內積累（圖(tu)3b），表明(ming)肽(tai)(tai)穿過外脂(zhi)雙層的(de)易位。此(ci)(ci)外，處理24小(xiao)時后(hou)，細(xi)(xi)胞(bao)邊界變得明(ming)顯模(mo)糊，這可能是(shi)因為在此(ci)(ci)過程中細(xi)(xi)胞(bao)膜(mo)(mo)的(de)結(jie)構逐漸退(tui)化。因此(ci)(ci)，人們很(hen)好地預期(qi)，在易位后(hou)，肽(tai)(tai)會與(yu)細(xi)(xi)胞(bao)內靶(ba)點（如線(xian)粒(li)體）相(xiang)互作用(yong)，觸發(fa)細(xi)(xi)胞(bao)凋(diao)亡。

圖3。肽(tai)(tai)的(de)原(yuan)位(wei)定(ding)位(wei)和(he)質膜完整性。（a）用10mM FITC-G（IIKK）3I-NH2孵育(yu)1h后HeLa細(xi)(xi)胞中的(de)肽(tai)(tai)位(wei)置。（b）用10mM FITC-G（IIKK）3I-NH2孵育(yu)24h后HeLa細(xi)(xi)胞中的(de)肽(tai)(tai)位(wei)置。（c）未經處理(li)的(de)HeLa細(xi)(xi)胞的(de)代表性SEM顯微(wei)照片(pian)。（d）用10mM G（IIKK）3I-NH2處理(li)24小時(shi)的(de)HeLa細(xi)(xi)胞的(de)代表性SEM顯微(wei)照片(pian)。

為了(le)確定與(yu)(yu)肽(tai)結合(he)后的(de)(de)(de)(de)膜(mo)(mo)通(tong)透(tou)性，我們進行了(le)鈣(gai)黃綠(lv)素(su)AM釋放(fang)試(shi)驗(yan)。與(yu)(yu)10 mM G（IIKK）3I-NH2孵(fu)育10 min導(dao)致(zhi)約(yue)20%的(de)(de)(de)(de)鈣(gai)黃綠(lv)酸(suan)從HeLa細胞中釋放(fang)，表明(ming)其(qi)對(dui)癌細胞膜(mo)(mo)的(de)(de)(de)(de)快(kuai)速滲透(tou)作用（參見補充數據，圖S2）。正如(ru)預期的(de)(de)(de)(de)那樣，增加培養時間會導(dao)致(zhi)更(geng)多的(de)(de)(de)(de)膜(mo)(mo)通(tong)透(tou)性，在培養6小時后，鈣(gai)黃綠(lv)素(su)AM的(de)(de)(de)(de)釋放(fang)超(chao)過(guo)40%。在較(jiao)短的(de)(de)(de)(de)培養時間內(nei)，明(ming)顯的(de)(de)(de)(de)膜(mo)(mo)通(tong)透(tou)性與(yu)(yu)上(shang)述觀察(cha)到的(de)(de)(de)(de)肽(tai)與(yu)(yu)癌細胞膜(mo)(mo)的(de)(de)(de)(de)快(kuai)速結合(he)非常(chang)一致(zhi)。

為了(le)直接觀察G（IIKK）3I-NH2對細(xi)(xi)胞(bao)(bao)形(xing)態(tai)的(de)影(ying)響，特別是在(zai)大多(duo)數肽分子轉移到膜(mo)(mo)上的(de)較長培養時(shi)間(jian)后，我們進行了(le)SEM檢(jian)查。未經(jing)處理(li)的(de)HeLa細(xi)(xi)胞(bao)(bao)顯(xian)(xian)示出(chu)正常(chang)的(de)光滑表面(mian)，相鄰(lin)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)之(zhi)間(jian)具有(you)良好(hao)的(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)間(jian)接觸（圖(tu)(tu)(tu)3c）。相比之(zhi)下(xia)，用10 mM G（IIKK）3I-NH2處理(li)24小時(shi)的(de)HeLa細(xi)(xi)胞(bao)(bao)在(zai)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)形(xing)態(tai)上表現(xian)出(chu)明顯(xian)(xian)的(de)改變（圖(tu)(tu)(tu)3d）。觀察到收(shou)縮(suo)的(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)膜(mo)(mo)明顯(xian)(xian)破裂和溶解。除了(le)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)膜(mo)(mo)損傷外(wai)，一些(xie)處理(li)過的(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)表現(xian)出(chu)嚴重(zhong)的(de)表面(mian)起泡（圖(tu)(tu)(tu)3d的(de)右圖(tu)(tu)(tu)），這是細(xi)(xi)胞(bao)(bao)凋亡(wang)執(zhi)行階段的(de)特征(zheng)性事件[20]。

3.4.細胞凋亡

由于肽易位到(dao)細(xi)胞(bao)質中，并(bing)且治療后(hou)的癌細(xi)胞(bao)出現(xian)了(le)凋亡形(xing)態學(xue)，我們(men)隨后(hou)遵循了(le)細(xi)胞(bao)凋亡的幾個關鍵(jian)生化和(he)形(xing)態學(xue)特征，旨在將(jiang)凋亡誘導與(yu)HeLa細(xi)胞(bao)死亡聯系起來，并(bing)揭示可(ke)能的凋亡途徑。

3.4.1.核形態變化與DNA斷裂

染(ran)色質凝聚(ju)與DNA片段(duan)(duan)化(hua)平(ping)行(xing)是(shi)(shi)用于識別(bie)細(xi)(xi)(xi)胞凋亡的(de)(de)可靠標準[21]。通(tong)過(guo)(guo)對細(xi)(xi)(xi)胞進行(xing)DAPI染(ran)色，我們首先比(bi)較了在37C溫度下用10 mM G（IIKK）3I-NH2處(chu)(chu)(chu)理(li)(li)24小時前(qian)后HeLa細(xi)(xi)(xi)胞的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞核變(bian)化(hua)（圖4a）。未經處(chu)(chu)(chu)理(li)(li)的(de)(de)HeLa細(xi)(xi)(xi)胞的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞核形態(tai)規(gui)則(ze)(ze)且完整，彌漫性(xing)DAPI染(ran)色。相反(fan)，隨(sui)著熒光強(qiang)度的(de)(de)增加(jia)，肽處(chu)(chu)(chu)理(li)(li)的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞核形狀發(fa)生(sheng)改(gai)變(bian)，染(ran)色質聚(ju)集成不(bu)規(gui)則(ze)(ze)的(de)(de)致密團塊。此外，在不(bu)同的(de)(de)培養時間(jian)從處(chu)(chu)(chu)理(li)(li)過(guo)(guo)的(de)(de)HeLa細(xi)(xi)(xi)胞中(zhong)提(ti)取基(ji)因組DNA，然后通(tong)過(guo)(guo)瓊脂糖凝膠電泳進行(xing)分(fen)析。孵(fu)育12小時后，出現寡核苷酸大小的(de)(de)DNA片段(duan)(duan)，并且隨(sui)著孵(fu)育時間(jian)的(de)(de)增加(jia)，模式變(bian)得更加(jia)明(ming)顯（圖4b）。相比(bi)之(zhi)下，從未經處(chu)(chu)(chu)理(li)(li)的(de)(de)HeLa細(xi)(xi)(xi)胞中(zhong)分(fen)離的(de)(de)DNA條帶是(shi)(shi)單一(yi)的(de)(de)，沒有發(fa)生(sheng)DNA斷裂。有人提(ti)出，一(yi)旦染(ran)色質完整性(xing)受損，一(yi)些激活酶(mei)（如內源性(xing)核酸酶(mei)）負(fu)責將染(ran)色質DNA切割成180e200 bp的(de)(de)片段(duan)(duan)及其整數倍[22e 24]。

圖4。細胞凋(diao)亡的(de)(de)生化和形態學特(te)征。（a）HeLa細胞與10 mM G（IIKK）3I-NH2孵(fu)育24小(xiao)時前后(hou)的(de)(de)DAPI核染(ran)色。（b）HeLa細胞與10 mM G（IIKK）3I-NH2孵(fu)育后(hou)提取的(de)(de)基因組DNA的(de)(de)凝膠電(dian)泳分(fen)析。（c）在與10 mM G（IIKK）3I-NH2孵(fu)育24小(xiao)時之(zhi)前和之(zhi)后(hou)，用(yong)FITC phalloidin對HeLa細胞進行F-肌動蛋白(bai)染(ran)色。

3.4.2.細胞骨架改變

肌動(dong)蛋白細胞(bao)(bao)骨架在介導細胞(bao)(bao)對內(nei)部和外部信號的(de)(de)反應中起著(zhu)至關重要的(de)(de)作用[25]。它(ta)有一個動(dong)態結構(gou)，具有獨特的(de)(de)形式，適用于運(yun)動(dong)、粘附、分裂和細胞(bao)(bao)死(si)亡(wang)等特定(ding)任務[26e28]。異常F-肌動(dong)蛋白動(dong)力學的(de)(de)發生與細胞(bao)(bao)凋亡(wang)的(de)(de)發展密切相關，通常伴隨著(zhu)ROS的(de)(de)線粒體釋(shi)放[28]。在與10 mM G（IIKK）3I-NH2孵育之前和之后，用FITC phalloidin對HeLa細胞(bao)(bao)進行染(ran)色，以顯(xian)示F-肌動(dong)蛋白（絲狀肌動(dong)蛋白）。對于未(wei)經處理的(de)(de)細胞(bao)(bao)，纖細的(de)(de)微絲束平行于細胞(bao)(bao)的(de)(de)長軸，而F-肌動(dong)蛋白隨著(zhu)處理的(de)(de)細胞(bao)(bao)變得紊亂和縮短（圖4c）。

3.4.3.線粒體途徑

線(xian)(xian)粒(li)(li)體(ti)(ti)(ti)(ti)在(zai)(zai)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)凋(diao)亡(wang)中起著(zhu)核心作用，凋(diao)亡(wang)死亡(wang)中的(de)(de)許多關(guan)鍵因素和(he)事件都受其調控(kong)。一些凋(diao)亡(wang)蛋白可以(yi)靶(ba)向線(xian)(xian)粒(li)(li)體(ti)(ti)(ti)(ti)，通過形成膜孔(kong)或增(zeng)(zeng)加線(xian)(xian)粒(li)(li)體(ti)(ti)(ti)(ti)膜通透性導(dao)致(zhi)線(xian)(xian)粒(li)(li)體(ti)(ti)(ti)(ti)腫脹(zhang)。這(zhe)兩(liang)個過程都允(yun)許釋(shi)放凋(diao)亡(wang)效應器[29e32]。在(zai)(zai)這(zhe)項工作中，成功地觀察(cha)到線(xian)(xian)粒(li)(li)體(ti)(ti)(ti)(ti)途(tu)徑(jing)與細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)凋(diao)亡(wang)有關(guan)。我們首先(xian)以(yi)JC-1為探(tan)針，觀察(cha)線(xian)(xian)粒(li)(li)體(ti)(ti)(ti)(ti)膜電位(wei)(wei)的(de)(de)變化[33]。未經處(chu)理的(de)(de)HeLa細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)顯示線(xian)(xian)粒(li)(li)體(ti)(ti)(ti)(ti)橙紅色(se)熒(ying)光(guang)和(he)少量綠色(se)熒(ying)光(guang)（網絡版(ban)）。與10 mM G（IIKK）3I-NH2孵育24小(xiao)時后，綠色(se)熒(ying)光(guang)占主導(dao)地位(wei)(wei)（圖5a），表(biao)明線(xian)(xian)粒(li)(li)體(ti)(ti)(ti)(ti)膜電位(wei)(wei)顯著(zhu)喪(sang)失。線(xian)(xian)粒(li)(li)體(ti)(ti)(ti)(ti)膜電位(wei)(wei)的(de)(de)這(zhe)種去(qu)極化通常伴(ban)隨著(zhu)線(xian)(xian)粒(li)(li)體(ti)(ti)(ti)(ti)膜通透性的(de)(de)增(zeng)(zeng)加和(he)Cyt c的(de)(de)釋(shi)放[34]。然后，我們進行了免疫熒(ying)光(guang)成像，該成像顯示未經處(chu)理的(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)中Cyt c的(de)(de)清晰、顆(ke)粒(li)(li)狀染(ran)色(se)模式，與G（IIKK）3I-NH2處(chu)理的(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)中Cyt c的(de)(de)更彌散染(ran)色(se)形成對比（圖5b）。這(zhe)種差異表(biao)明細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)色(se)素c從線(xian)(xian)粒(li)(li)體(ti)(ti)(ti)(ti)釋(shi)放到細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)質中，與觀察(cha)到的(de)(de)線(xian)(xian)粒(li)(li)體(ti)(ti)(ti)(ti)膜電位(wei)(wei)去(qu)極化高度一致(zhi)。在(zai)(zai)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)質中，釋(shi)放的(de)(de)Cyt-c可以(yi)在(zai)(zai)dATP存在(zai)(zai)下誘導(dao)Apaf-1和(he)caspase-9之間的(de)(de)相(xiang)互作用，從而進一步激活caspase級聯反應并觸發細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)凋(diao)亡(wang)[35]。

圖(tu)5.圖(tu)5。線(xian)粒體(ti)功能障礙(ai)與(yu)Fas-FasL通路。（a）用(yong)10mM G（IIKK）3I-NH2孵育24小時前后HeLa細(xi)胞的JC-1線(xian)粒體(ti)膜電位染(ran)色的熒光圖(tu)像。（b）用(yong)10mM G（IIKK）3I-NH2孵育24小時前后HeLa細(xi)胞的Cyt c免疫熒光染(ran)色。（c）Caspase-8，與(yu)10 mM G（IIKK）3I-NH2孵育后HeLa細(xi)胞的fas-L和fas基因轉錄。

3.4.4.死亡受體途徑

線粒(li)體(ti)(ti)調(diao)節的(de)(de)(de)(de)(de)細胞(bao)(bao)凋(diao)亡可通過其(qi)他(ta)受體(ti)(ti)相關途(tu)徑(jing)放(fang)大(da)，如(ru)Fas與(yu)其(qi)配體(ti)(ti)（Fas-L）的(de)(de)(de)(de)(de)相互作(zuo)用[36]。為了(le)(le)(le)(le)研(yan)究該肽(tai)是(shi)否啟動(dong)了(le)(le)(le)(le)死(si)亡受體(ti)(ti)途(tu)徑(jing)，我們(men)進行了(le)(le)(le)(le)實(shi)時PCR分(fen)析，以分(fen)析相關基因轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)(lu)（caspase-8、fas和fas-L）。10mM G（IIKK）3I-NH2處理的(de)(de)(de)(de)(de)HeLa細胞(bao)(bao)在3至6h內的(de)(de)(de)(de)(de)caspase-8轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)(lu)水平明顯升高(gao)，而在孵育12h后(hou)急劇下降至正常值。fas和fas-L的(de)(de)(de)(de)(de)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)(lu)遵循相同的(de)(de)(de)(de)(de)趨勢（圖5c）。兩個基因（fas和fas-L）的(de)(de)(de)(de)(de)高(gao)表達增加(jia)(jia)了(le)(le)(le)(le)它們(men)相互作(zuo)用的(de)(de)(de)(de)(de)機會。這兩種分(fen)子(zi)的(de)(de)(de)(de)(de)結合誘(you)導(dao)了(le)(le)(le)(le)死(si)亡誘(you)導(dao)信號(hao)復合物（DISC）的(de)(de)(de)(de)(de)形成，其(qi)中含有半胱(guang)(guang)天(tian)冬酶(mei)-8和半胱(guang)(guang)天(tian)冬酶(mei)-10[36,37]。Fas圓盤啟動(dong)了(le)(le)(le)(le)一(yi)個反饋回路(lu)，螺旋(xuan)上(shang)升，增加(jia)(jia)了(le)(le)(le)(le)線粒(li)體(ti)(ti)促凋(diao)亡因子(zi)的(de)(de)(de)(de)(de)釋(shi)放(fang)和caspase-8的(de)(de)(de)(de)(de)放(fang)大(da)激活[38]。另(ling)一(yi)方面，半胱(guang)(guang)天(tian)冬酶(mei)-8誘(you)導(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)凋(diao)亡也可以通過刺激線粒(li)體(ti)(ti)釋(shi)放(fang)Cyt c來(lai)放(fang)大(da)[39]。在G（IIKK）3INH2處理的(de)(de)(de)(de)(de)HeLa細胞(bao)(bao)中，死(si)亡受體(ti)(ti)通路(lu)基因的(de)(de)(de)(de)(de)高(gao)轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)(lu)意味著該肽(tai)誘(you)導(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)細胞(bao)(bao)凋(diao)亡也參與(yu)了(le)(le)(le)(le)死(si)亡受體(ti)(ti)依賴的(de)(de)(de)(de)(de)方式(shi)。

3.5.免疫效應

從活生(sheng)物體(ti)中分(fen)離的(de)(de)(de)天然抗(kang)菌(jun)肽在臨床(chuang)上的(de)(de)(de)應(ying)(ying)(ying)用(yong)(yong)非常(chang)有限，因(yin)為它們的(de)(de)(de)生(sheng)產(chan)成本高、溶(rong)血性高以及可能的(de)(de)(de)免(mian)(mian)(mian)疫(yi)效應(ying)(ying)(ying)[16]。除了通(tong)(tong)過高細胞(bao)(bao)選擇性降低(di)生(sheng)產(chan)成本和(he)(he)溶(rong)血作(zuo)用(yong)(yong)外，所設計的(de)(de)(de)螺旋(xuan)肽的(de)(de)(de)非免(mian)(mian)(mian)疫(yi)效應(ying)(ying)(ying)對于開發其(qi)潛在應(ying)(ying)(ying)用(yong)(yong)也(ye)至關(guan)重要。兩(liang)個細胞(bao)(bao)因(yin)子(zi)(zi)基(ji)因(yin)IL2和(he)(he)IL8被(bei)認(ren)為是主要的(de)(de)(de)免(mian)(mian)(mian)疫(yi)系(xi)統信號分(fen)子(zi)(zi)，它們能夠對微(wei)生(sheng)物感染(ran)做出(chu)反應(ying)(ying)(ying)，并將外來分(fen)子(zi)(zi)（非自身）與(yu)人體(ti)自身細胞(bao)(bao)和(he)(he)分(fen)子(zi)(zi)（自身）區(qu)分(fen)開來[40,41]。因(yin)此，這兩(liang)個基(ji)因(yin)的(de)(de)(de)高表(biao)達通(tong)(tong)常(chang)會誘發急性和(he)(he)慢性炎癥。因(yin)此，在用(yong)(yong)肽G（IIKK）3I-NH2處(chu)理人類淋巴細胞(bao)(bao)后，使(shi)用(yong)(yong)RT-PCR分(fen)析(xi)其(qi)細胞(bao)(bao)因(yin)子(zi)(zi)基(ji)因(yin)IL2和(he)(he)IL8的(de)(de)(de)轉錄(lu)水平。如圖S3所示，肽培養后淋巴細胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)IL2和(he)(he)IL8的(de)(de)(de)相對轉錄(lu)水平低(di)于或幾乎等于相應(ying)(ying)(ying)對照組的(de)(de)(de)水平，表(biao)明G（IIKK）3I-NH2與(yu)淋巴細胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)相互作(zuo)用(yong)(yong)不會誘導非特異性免(mian)(mian)(mian)疫(yi)原性反應(ying)(ying)(ying)。

3.6.體內抗腫瘤性能

將人宮頸癌HeLa細胞接種于(yu)裸(luo)鼠皮(pi)下。腫(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)植入5天后(hou)，分別(bie)以(yi)(yi)1.5 mg/kg和(he)(he)5 mg/kg的(de)(de)劑量腹腔注射肽G（IIKK）3INH2和(he)(he)G（IIKK）4I-NH2。在給藥期間，未觀察(cha)(cha)到任何毒性跡象，如(ru)體重(zhong)(zhong)減輕和(he)(he)外(wai)(wai)觀不(bu)良(liang)（圖6b），盡(jin)管G（IIKK）4I-NH2顯(xian)(xian)示出(chu)更(geng)高的(de)(de)體外(wai)(wai)溶血性。與PBS中的(de)(de)陰性對(dui)照(zhao)相比，這(zhe)(zhe)兩種肽對(dui)腫(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)生(sheng)長(chang)表(biao)(biao)現出(chu)明顯(xian)(xian)的(de)(de)抑制(zhi)(zhi)作用(yong)(yong)，其中G（IIKK）4I-NH2表(biao)(biao)現出(chu)比G（IIKK）3I-NH2更(geng)好(hao)的(de)(de)療(liao)效(xiao)（圖6c），這(zhe)(zhe)與它(ta)們的(de)(de)體外(wai)(wai)抗腫(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)趨勢一致。18天后(hou)，解(jie)剖腫(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)并稱重(zhong)(zhong)（圖6a和(he)(he)d）。在1.5 mg/kg和(he)(he)5 mg/kg劑量下，G（IIKK）3I-NH2治療(liao)組(zu)的(de)(de)腫(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)生(sheng)長(chang)抑制(zhi)(zhi)率(lv)分別(bie)為0.23和(he)(he)0.31。G（IIKK）4I-NH2能(neng)產生(sheng)更(geng)有(you)效(xiao)的(de)(de)抑制(zhi)(zhi)作用(yong)(yong)，在1.5 mg/kg和(he)(he)5 mg/kg劑量下，抑制(zhi)(zhi)率(lv)分別(bie)為0.32和(he)(he)0.41。這(zhe)(zhe)些數據(ju)表(biao)(biao)明，在小鼠異種移植模(mo)型中，螺旋肽可(ke)以(yi)(yi)有(you)效(xiao)地(di)抑制(zhi)(zhi)腫(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)生(sheng)長(chang)，而腫(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)細胞不(bu)能(neng)被完全清除。許多(duo)抗腫(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)藥物的(de)(de)不(bu)完全抑制(zhi)(zhi)作用(yong)(yong)已被廣泛(fan)觀察(cha)(cha)到，這(zhe)(zhe)可(ke)歸因(yin)于(yu)多(duo)種機制(zhi)(zhi)，例(li)如(ru)藥物從腫(zhong)(zhong)(zhong)瘤(liu)(liu)部位相對(dui)較(jiao)快地(di)清除，以(yi)(yi)及它(ta)們難以(yi)(yi)通過(guo)壞死(si)區域(yu)擴散[42]，但(dan)目前這(zhe)(zhe)組(zu)肽背后(hou)的(de)(de)確切原因(yin)有(you)待進(jin)一步的(de)(de)機理研究。

圖6。人宮頸癌裸鼠(shu)移植瘤(liu)(liu)的(de)體(ti)內抗腫(zhong)瘤(liu)(liu)作(zuo)用(yong)。（a）給(gei)藥(yao)后解剖腫(zhong)瘤(liu)(liu)。（b）給(gei)藥(yao)期(qi)間體(ti)重變化。（c）給(gei)藥(yao)期(qi)間腫(zhong)瘤(liu)(liu)體(ti)積的(de)變化。（d）給(gei)藥(yao)后的(de)腫(zhong)瘤(liu)(liu)抑制率。

4.討論

這(zhe)些設計的(de)(de)(de)(de)(de)肽短而(er)規則。與典型的(de)(de)(de)(de)(de)天然AMPs和(he)(he)流(liu)行的(de)(de)(de)(de)(de)抗(kang)癌藥物順(shun)鉑相(xiang)比，它(ta)們在(zai)(zai)抑制癌細胞生(sheng)長(chang)方面(mian)(mian)的(de)(de)(de)(de)(de)結構簡單、效力高、副作用小，使它(ta)們成為基礎研究(jiu)和(he)(he)應用研究(jiu)的(de)(de)(de)(de)(de)理想模型和(he)(he)靶點。這(zhe)些肽在(zai)(zai)界(jie)面(mian)(mian)性質和(he)(he)生(sheng)物活性方面(mian)(mian)表現出系統(tong)性的(de)(de)(de)(de)(de)變化。我們面(mian)(mian)臨的(de)(de)(de)(de)(de)直接挑戰(zhan)是如何將(jiang)分(fen)子結構設計、界(jie)面(mian)(mian)性質和(he)(he)破壞細胞膜的(de)(de)(de)(de)(de)選擇性聯系起來。這(zhe)代表了功能性生(sheng)物材料研究(jiu)的(de)(de)(de)(de)(de)核心(xin)努力，從而(er)在(zai)(zai)未來肽抗(kang)生(sheng)素的(de)(de)(de)(de)(de)合理設計和(he)(he)對其(qi)抗(kang)腫瘤性能的(de)(de)(de)(de)(de)理解中獲得更好(hao)的(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)子洞察力。

我們(men)之(zhi)前在共培養環境下使用NIH 3T3細(xi)(xi)胞系作(zuo)為(wei)宿(su)主(zhu)細(xi)(xi)胞的(de)(de)(de)研究(jiu)表(biao)明，這(zhe)些肽(tai)對(dui)(dui)細(xi)(xi)菌和癌細(xi)(xi)胞的(de)(de)(de)作(zuo)用模式大致相(xiang)(xiang)似(si)，并解釋(shi)了為(wei)什么它們(men)不會對(dui)(dui)正常哺乳(ru)動物(wu)細(xi)(xi)胞造成傷害[8]。由(you)于磷脂(zhi)酰絲氨(an)酸、O-糖(tang)基(ji)化(hua)粘(zhan)蛋白、唾液化(hua)神(shen)經節苷脂(zhi)和硫酸肝素的(de)(de)(de)表(biao)達升高，腫(zhong)瘤細(xi)(xi)胞膜(mo)也攜帶凈負電(dian)荷。這(zhe)種外膜(mo)表(biao)面(mian)的(de)(de)(de)負電(dian)荷特征與(yu)細(xi)(xi)菌非常相(xiang)(xiang)似(si)。這(zhe)些肽(tai)和靶(ba)膜(mo)之(zhi)間的(de)(de)(de)靜電(dian)相(xiang)(xiang)互作(zuo)用對(dui)(dui)選擇性反(fan)應至關重要。

在所研究的(de)(de)(de)短肽(tai)(tai)(tai)系列中，G（IIKK）3I-NH2代表了(le)體(ti)(ti)外抗(kang)(kang)癌(ai)活(huo)性(xing)(xing)(xing)和(he)(he)(he)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)選(xuan)擇(ze)(ze)性(xing)(xing)(xing)方面的(de)(de)(de)最佳鏈(lian)(lian)長，與之前報道的(de)(de)(de)抗(kang)(kang)菌活(huo)性(xing)(xing)(xing)和(he)(he)(he)選(xuan)擇(ze)(ze)性(xing)(xing)(xing)觀察結果一致。已經證明，對細(xi)(xi)(xi)菌和(he)(he)(he)癌(ai)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)共同區別反應(ying)源自(zi)肽(tai)(tai)(tai)通(tong)過(guo)靜電相(xiang)互作(zuo)用和(he)(he)(he)疏水效應(ying)之間的(de)(de)(de)平衡(heng)對不同細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)膜(mo)的(de)(de)(de)選(xuan)擇(ze)(ze)性(xing)(xing)(xing)反應(ying)。具體(ti)(ti)而(er)言(yan)，負表面電荷和(he)(he)(he)高度不飽和(he)(he)(he)脂鏈(lian)(lian)驅動(dong)的(de)(de)(de)對癌(ai)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)高親和(he)(he)(he)力導(dao)致G（IIKK）3I-NH2與癌(ai)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)膜(mo)的(de)(de)(de)快速結合，并隨(sui)后導(dao)致膜(mo)通(tong)透性(xing)(xing)(xing)。肽(tai)(tai)(tai)分(fen)子隨(sui)后通(tong)過(guo)脂質雙層轉移(yi)，并積聚在癌(ai)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)內部。這(zhe)一過(guo)程(cheng)產生了(le)一系列細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)凋(diao)亡的(de)(de)(de)形(xing)態學和(he)(he)(he)生化特(te)征(zheng)，表明肽(tai)(tai)(tai)處理的(de)(de)(de)癌(ai)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)因膜(mo)破壞和(he)(he)(he)凋(diao)亡而(er)死(si)亡。此外，這(zhe)項工(gong)作(zuo)還揭示了(le)肽(tai)(tai)(tai)誘導(dao)的(de)(de)(de)癌(ai)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)凋(diao)亡與兩個特(te)征(zheng)性(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)分(fen)子過(guo)程(cheng)有關：線(xian)粒體(ti)(ti)途徑和(he)(he)(he)死(si)亡受體(ti)(ti)途徑。

這些肽在(zai)與淋巴細胞相(xiang)互(hu)作(zuo)用(yong)后(hou)不會誘導(dao)非特(te)異性(xing)(xing)(xing)(xing)免疫(yi)原性(xing)(xing)(xing)(xing)反應，重(zhong)要的(de)(de)是，它們(men)在(zai)裸(luo)鼠體內對(dui)(dui)異種移(yi)植物顯示出相(xiang)當大的(de)(de)生(sheng)長抑制作(zuo)用(yong)，對(dui)(dui)宿主毒(du)性(xing)(xing)(xing)(xing)很小，因(yin)此表明它們(men)在(zai)臨(lin)床開發中具有(you)巨(ju)大潛力。這些數(shu)據共同構(gou)成了設(she)計(ji)具有(you)優異生(sheng)物相(xiang)容性(xing)(xing)(xing)(xing)和(he)(he)選擇性(xing)(xing)(xing)(xing)的(de)(de)短肽生(sheng)物材料的(de)(de)新范例的(de)(de)基礎。迄今為(wei)止(zhi)，許多AMP通過(guo)從(cong)天然蛋白質和(he)(he)肽中提取(qu)氨基酸序列來(lai)強調(diao)仿(fang)生(sheng)作(zuo)用(yong)。相(xiang)比之下，在(zai)目前的(de)(de)工作(zuo)中，我們(men)采用(yong)了IIKK序列模(mo)塊(kuai)基本單元的(de)(de)最(zui)小模(mo)擬，然后(hou)采用(yong)人工重(zhong)復（n）和(he)(he)選擇性(xing)(xing)(xing)(xing)終端阻斷，從(cong)而(er)大大提高了性(xing)(xing)(xing)(xing)能。未來(lai)的(de)(de)工作(zuo)可以評(ping)估仿(fang)生(sheng)學(xue)如何(he)與合(he)理(li)的(de)(de)結構(gou)設(she)計(ji)相(xiang)協調(diao)。目前尚不清(qing)楚一級(ji)序列的(de)(de)變(bian)(bian)化(hua)，例如用(yong)L、V和(he)(he)A替換I，或(huo)用(yong)R替換K，以及任何(he)帶有(you)短側鏈(lian)的(de)(de)非天然陽離子氨基酸，將如何(he)改(gai)變(bian)(bian)效(xiao)力和(he)(he)選擇性(xing)(xing)(xing)(xing)。

另一(yi)(yi)(yi)方面(mian)(mian)(mian)，雖(sui)然(ran)(ran)短(duan)肽(tai)(tai)對(dui)(dui)不同(tong)(tong)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)類型的(de)(de)(de)(de)選擇性反應符合實(shi)(shi)驗觀(guan)察結(jie)果(guo)，但(dan)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)外膜表(biao)面(mian)(mian)(mian)精細(xi)(xi)而(er)復雜。目前基(ji)于(yu)選擇性靜(jing)電相(xiang)(xiang)互(hu)作(zuo)用(yong)的(de)(de)(de)(de)解(jie)釋充(chong)其量只能(neng)(neng)是一(yi)(yi)(yi)種(zhong)簡化的(de)(de)(de)(de)合理化。需要進(jin)一(yi)(yi)(yi)步研(yan)究(jiu)，通過(guo)不同(tong)(tong)層次的(de)(de)(de)(de)模型界(jie)面(mian)(mian)(mian)表(biao)示來(lai)揭(jie)示詳細(xi)(xi)的(de)(de)(de)(de)分子過(guo)程(cheng)，從而(er)更直接地了解(jie)不同(tong)(tong)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)和亞細(xi)(xi)胞(bao)(bao)界(jie)面(mian)(mian)(mian)上的(de)(de)(de)(de)不同(tong)(tong)相(xiang)(xiang)互(hu)作(zuo)用(yong)。因此，目前的(de)(de)(de)(de)工作(zuo)為(wei)探(tan)索新的(de)(de)(de)(de)科學理解(jie)開(kai)辟了一(yi)(yi)(yi)系列(lie)具有(you)挑戰(zhan)性但(dan)令人(ren)興奮的(de)(de)(de)(de)實(shi)(shi)驗機會。結(jie)合短(duan)設計功(gong)能(neng)(neng)肽(tai)(tai)開(kai)發(fa)相(xiang)(xiang)關的(de)(de)(de)(de)模型生(sheng)物(wu)界(jie)面(mian)(mian)(mian)將(jiang)促(cu)進(jin)新的(de)(de)(de)(de)實(shi)(shi)驗能(neng)(neng)力(li)(li)(li)，包(bao)括各種(zhong)表(biao)面(mian)(mian)(mian)和界(jie)面(mian)(mian)(mian)成(cheng)像、反射和散射，使(shi)用(yong)激(ji)光、x射線和中子束源。這(zhe)(zhe)(zhe)些(xie)實(shi)(shi)驗不僅將(jiang)增加對(dui)(dui)生(sheng)物(wu)界(jie)面(mian)(mian)(mian)過(guo)程(cheng)的(de)(de)(de)(de)新理解(jie)，還將(jiang)催生(sheng)新技(ji)術。最后，之前的(de)(de)(de)(de)研(yan)究(jiu)表(biao)明，表(biao)面(mian)(mian)(mian)活性劑(ji)樣短(duan)肽(tai)(tai)（如(ru)A9K）在抑(yi)制(zhi)癌癥生(sheng)長(chang)方面(mian)(mian)(mian)也表(biao)現出(chu)很高的(de)(de)(de)(de)效(xiao)力(li)(li)(li)和選擇性[11]，但(dan)這(zhe)(zhe)(zhe)些(xie)肽(tai)(tai)促(cu)進(jin)了水和膜樣環境下的(de)(de)(de)(de)b-折疊構(gou)(gou)象(xiang)，而(er)不是本研(yan)究(jiu)中報道(dao)的(de)(de)(de)(de)a-螺(luo)旋(xuan)構(gou)(gou)象(xiang)。目前還不清楚(chu)如(ru)何(he)不同(tong)(tong)的(de)(de)(de)(de)二級結(jie)構(gou)(gou)可能(neng)(neng)導致等(deng)效(xiao)的(de)(de)(de)(de)高效(xiao)力(li)(li)(li)和選擇性，但(dan)具有(you)明確的(de)(de)(de)(de)分子結(jie)構(gou)(gou)奠定了一(yi)(yi)(yi)個有(you)用(yong)的(de)(de)(de)(de)基(ji)礎，為(wei)我們(men)探(tan)討這(zhe)(zhe)(zhe)些(xie)重(zhong)要的(de)(de)(de)(de)差異(yi)，在未來(lai)的(de)(de)(de)(de)研(yan)究(jiu)。對(dui)(dui)于(yu)從事跨(kua)學科研(yan)究(jiu)的(de)(de)(de)(de)物(wu)理學家和材料研(yan)究(jiu)人(ren)員來(lai)說，這(zhe)(zhe)(zhe)些(xie)合理設計的(de)(de)(de)(de)模型比已經報道(dao)的(de)(de)(de)(de)各種(zhong)天(tian)然(ran)(ran)AMP和同(tong)(tong)系物(wu)更易于(yu)處理。無論爭論的(de)(de)(de)(de)方向和結(jie)果(guo)如(ru)何(he)，這(zhe)(zhe)(zhe)些(xie)短(duan)肽(tai)(tai)都(dou)將(jiang)引起廣泛的(de)(de)(de)(de)興趣來(lai)探(tan)索其功(gong)能(neng)(neng)用(yong)途。效(xiao)力(li)(li)(li)的(de)(de)(de)(de)變(bian)化有(you)不同(tong)(tong)的(de)(de)(de)(de)含義。例如(ru)，很短(duan)的(de)(de)(de)(de)肽(tai)(tai)可以(yi)用(yong)于(yu)皮膚護理，而(er)較長(chang)的(de)(de)(de)(de)、效(xiao)力(li)(li)(li)更大的(de)(de)(de)(de)肽(tai)(tai)可以(yi)用(yong)于(yu)治療開(kai)發(fa)。

5.結論

在(zai)(zai)一(yi)系列(lie)(lie)短肽(tai)G（IIKK）nI-NH2（n?1e4）中(zhong)，G（IIKK）3I-NH2代(dai)表(biao)(biao)(biao)(biao)了體外抗(kang)癌活性(xing)和(he)(he)細(xi)胞選(xuan)擇性(xing)方面的(de)(de)(de)(de)最佳(jia)鏈(lian)長，與(yu)(yu)之(zhi)前在(zai)(zai)抗(kang)菌(jun)活性(xing)和(he)(he)選(xuan)擇性(xing)方面的(de)(de)(de)(de)觀察(cha)結(jie)果一(yi)致。已經證明(ming)(ming)，對細(xi)菌(jun)和(he)(he)癌細(xi)胞的(de)(de)(de)(de)共(gong)同鑒別反應(ying)源于肽(tai)通(tong)過(guo)靜電(dian)相(xiang)互作(zuo)(zuo)用和(he)(he)疏水(shui)效(xiao)應(ying)之(zhi)間的(de)(de)(de)(de)平衡而(er)(er)產生(sheng)的(de)(de)(de)(de)選(xuan)擇性(xing)反應(ying)。具體而(er)(er)言(yan)，負表(biao)(biao)(biao)(biao)面電(dian)荷和(he)(he)高(gao)不(bu)(bu)飽(bao)和(he)(he)脂鏈(lian)驅(qu)動的(de)(de)(de)(de)高(gao)親和(he)(he)力導(dao)致G（IIKK）3I-NH2與(yu)(yu)癌細(xi)胞膜的(de)(de)(de)(de)快(kuai)速結(jie)合和(he)(he)隨(sui)后(hou)的(de)(de)(de)(de)膜通(tong)透(tou)性(xing)。然后(hou)，肽(tai)分子通(tong)過(guo)脂質雙層(ceng)轉運，并在(zai)(zai)癌細(xi)胞內部(bu)積聚。這一(yi)過(guo)程產生(sheng)了一(yi)系列(lie)(lie)細(xi)胞凋亡(wang)(wang)的(de)(de)(de)(de)形態(tai)學(xue)和(he)(he)生(sheng)化特征，表(biao)(biao)(biao)(biao)明(ming)(ming)肽(tai)處理(li)的(de)(de)(de)(de)癌細(xi)胞因(yin)膜破壞和(he)(he)凋亡(wang)(wang)而(er)(er)死亡(wang)(wang)。此外，這項(xiang)工作(zuo)(zuo)還揭示(shi)了肽(tai)誘導(dao)的(de)(de)(de)(de)癌細(xi)胞凋亡(wang)(wang)與(yu)(yu)兩(liang)(liang)個特征性(xing)的(de)(de)(de)(de)分子過(guo)程有關(guan)：線粒體途徑(jing)(jing)和(he)(he)死亡(wang)(wang)受(shou)體途徑(jing)(jing)。最后(hou)，該肽(tai)在(zai)(zai)與(yu)(yu)淋巴細(xi)胞相(xiang)互作(zuo)(zuo)用后(hou)不(bu)(bu)會誘導(dao)非特異(yi)性(xing)免疫原性(xing)反應(ying)，重(zhong)要的(de)(de)(de)(de)是，這些設(she)計的(de)(de)(de)(de)肽(tai)在(zai)(zai)異(yi)種移植模型(xing)中(zhong)顯(xian)示(shi)出相(xiang)當大(da)的(de)(de)(de)(de)體內抗(kang)腫瘤作(zuo)(zuo)用，而(er)(er)毒(du)性(xing)很小，這兩(liang)(liang)者都表(biao)(biao)(biao)(biao)明(ming)(ming)它們作(zuo)(zuo)為功(gong)能材料在(zai)(zai)生(sheng)物(wu)技(ji)術和(he)(he)臨床應(ying)用中(zhong)的(de)(de)(de)(de)潛力。

致謝

這項工作得到(dao)了中國國家(jia)自(zi)(zi)然科(ke)(ke)學基金資助31271497,30900765號和(he)(he)21033005號，山東省自(zi)(zi)然科(ke)(ke)學基金（ZR2009 9DQ00 1和(he)(he)JQ201105）和(he)(he)中央大學基礎研(yan)究基金（12CX04052A）的資助。我(wo)們(men)還感謝(xie)英(ying)國工程和(he)(he)物理科(ke)(ke)學研(yan)究委員會（EPSRC）的支(zhi)持。我(wo)們(men)感謝(xie)英(ying)國皇家(jia)學會（倫敦）為HX提供(gong)中英(ying)獎學金。