結果

純(chun)(chun)天然(ran)PIP2的(de)(de)(de)相行為(wei)。通過(guo)將PIP2單(dan)分(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)膜從250?2/分(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)壓(ya)(ya)(ya)(ya)縮至50?2/分(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)，并觀察(cha)壓(ya)(ya)(ya)(ya)縮對(dui)界面表(biao)(biao)面壓(ya)(ya)(ya)(ya)力(li)的(de)(de)(de)影響，研(yan)究了純(chun)(chun)天然(ran)衍生(sheng)PIP2的(de)(de)(de)表(biao)(biao)面壓(ya)(ya)(ya)(ya)力(li)（π）與分(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)面積之間的(de)(de)(de)關系。10個單(dan)獨試驗(yan)的(de)(de)(de)平(ping)均等溫(wen)線(xian)如圖1a所(suo)示(shi)。正如純(chun)(chun)PIP2酰基(ji)鏈的(de)(de)(de)已知組成所(suo)預(yu)期的(de)(de)(de)那樣(～50%不飽和，33%花(hua)生(sheng)四烯(xi)酸），隨著分(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)面積的(de)(de)(de)減小，這些(xie)(xie)等溫(wen)線(xian)顯示(shi)出(chu)表(biao)(biao)面壓(ya)(ya)(ya)(ya)力(li)平(ping)滑、單(dan)調的(de)(de)(de)增(zeng)加(jia)。在這些(xie)(xie)實驗(yan)中使用的(de)(de)(de)任何條(tiao)件(jian)下，均未觀察(cha)到(dao)PIP2單(dan)分(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)膜的(de)(de)(de)相變。與生(sheng)理(li)條(tiao)件(jian)相對(dui)應(ying)的(de)(de)(de)表(biao)(biao)面壓(ya)(ya)(ya)(ya)力(li)下PIP2的(de)(de)(de)平(ping)均面積(～30 mN/m 27）為(wei)73.1（3.0?2/分(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)，略(lve)大于(yu)SAPC（65?2）的(de)(de)(de)公布值(zhi)，28這是(shi)根(gen)據糖頭(tou)基(ji)的(de)(de)(de)添加(jia)體積和靜(jing)電(dian)排斥預(yu)期的(de)(de)(de)。盡管(guan)在生(sheng)理(li)pH下PIP2頭(tou)基(ji)的(de)(de)(de)大小和相對(dui)較高的(de)(de)(de)電(dian)荷密(mi)度，但該(gai)分(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)很容(rong)易形成緊(jin)密(mi)壓(ya)(ya)(ya)(ya)縮的(de)(de)(de)單(dan)分(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)膜，而不是(shi)在較高的(de)(de)(de)表(biao)(biao)面壓(ya)(ya)(ya)(ya)力(li)下坍塌(ta)成水膠(jiao)束結構(gou)。在所(suo)有(you)條(tiao)件(jian)下，由于(yu)屏障泄漏或單(dan)層崩塌(ta)導致(zhi)的(de)(de)(de)脂質損失導致(zhi)的(de)(de)(de)單(dan)層遲滯可(ke)以忽略(lve)不計(ji)，類似于(yu)SOPC等對(dui)照(zhao)脂質（數據未顯示(shi)）。

離子(zi)強度(du)增加對PIP2單分(fen)子(zi)膜的擴展(zhan)效應(ying)。為(wei)了(le)研究離子(zi)強度(du)對PIP2單分(fen)子(zi)膜行為(wei)的影(ying)響，在(zai)(zai)亞相(xiang)(xiang)(xiang)不同濃(nong)度(du)的NaCl下(xia)取了(le)π-A等溫(wen)(wen)線。在(zai)(zai)高于5 mN/m的所有表(biao)(biao)面壓力下(xia)，添(tian)(tian)加NaCl可顯(xian)(xian)著擴展(zhan)單分(fen)子(zi)膜（圖(tu)1a）。在(zai)(zai)預(yu)先形成的PIP2單層的亞相(xiang)(xiang)(xiang)中(zhong)加入NaCl時(shi)也(ye)觀(guan)(guan)察(cha)到了(le)這種反應(ying)。在(zai)(zai)恒定分(fen)子(zi)面積(ji)下(xia)，添(tian)(tian)加250 mM NaCl后，表(biao)(biao)面壓力增加，其(qi)大小(xiao)與(yu)等溫(wen)(wen)線實驗中(zhong)觀(guan)(guan)察(cha)到的大小(xiao)相(xiang)(xiang)(xiang)當，在(zai)(zai)擴散(san)限(xian)制(zhi)時(shi)間尺度(du)上（圖(tu)1a插(cha)圖(tu)）。在(zai)(zai)π）30 mN/m時(shi)，每個PIP2分(fen)子(zi)的面積(ji)增加了(le)13%，達到82.5?2/分(fen)子(zi)（圖(tu)1b）。該(gai)效應(ying)的劑量反應(ying)量化(hua)表(biao)(biao)明，該(gai)效應(ying)在(zai)(zai)約(yue)200 mM NaCl下(xia)飽和，并在(zai)(zai)生理(li)相(xiang)(xiang)(xiang)關(guan)鹽濃(nong)度(du)范圍內(nei)顯(xian)(xian)示出顯(xian)(xian)著變(bian)化(hua)（圖(tu)1c）。

圖(tu)1：。NaCl對(dui)PIP2單分子(zi)膜的擴張(zhang)效(xiao)應。（A）π-含0 mM（9）和(he)250 mM NaCl（2）的等(deng)溫線；（插圖(tu)）亞(ya)相(xiang)注入250 mM NaCl（時間）0時，恒定面積/分子(zi)的表(biao)面壓力(li)變化。（B）在pH 1.8（n）7）和(he)pH 7.4（n）5）條件下，30 mN/m的每個分子(zi)的面積。（C）對(dui)亞(ya)相(xiang)NaCl的劑量反應。誤(wu)差條為(wei)平均(jun)值（n處為(wei)SE）5，除(chu)非另有說明。所有數據均(jun)為(wei)HEPES緩沖亞(ya)相(xiang)的L-R PIP2，pH 7.4（除(chu)非另有說明），30°C。

為了測(ce)試靜(jing)電機制（如反離子云排斥）導(dao)致單(dan)層(ceng)膨脹的(de)(de)(de)可(ke)能性，使用與PIP2實驗相同的(de)(de)(de)條件，測(ce)量(liang)了250 mM NaCl對另一種帶電脂質L-R PS的(de)(de)(de)影(ying)響。PS的(de)(de)(de)單(dan)分(fen)(fen)子膜與PIP2的(de)(de)(de)單(dan)分(fen)(fen)子膜沒有受到相同的(de)(de)(de)影(ying)響，相反，隨著亞相離子強(qiang)度的(de)(de)(de)增加，PS的(de)(de)(de)單(dan)分(fen)(fen)子膜表現出(chu)非常輕微的(de)(de)(de)收縮（圖2a）。

圖2：。鹽(yan)膨脹效應對PIP2的特(te)異性。（A）L-R PIP2和L-R PS的每分子(zi)面積；和（B）HEPES緩沖(chong)亞相上的L-R PIP2、L-R PI（4）P和L-R PI，pH 7.4，π）30mN/m下的30°C。平均值（SE，n）4。

為了確定PIP2特異性膨脹是(shi)否主要(yao)由大塊肌(ji)醇(chun)環引(yin)起(qi)，同時控制酰基鏈組成(cheng)(cheng)，用磷(lin)(lin)脂酰肌(ji)醇(chun)4-磷(lin)(lin)酸（LR PI（4）P）和(he)磷(lin)(lin)脂酰肌(ji)醇(chun)（LR PI）重(zhong)復壓力面(mian)積(ji)等(deng)溫線。由于這些(xie)分(fen)(fen)(fen)子是(shi)細胞中酶促PIP2生成(cheng)(cheng)的(de)(de)前體，它們(men)的(de)(de)脂肪酸組成(cheng)(cheng)與(yu)PIP2相(xiang)似(si)或相(xiang)同，只是(shi)在肌(ji)醇(chun)環上的(de)(de)磷(lin)(lin)酸取代(dai)程度不同。與(yu)PIP2一樣，兩(liang)種肌(ji)醇(chun)基脂質(zhi)均未(wei)觀(guan)(guan)察(cha)(cha)到相(xiang)變，平均分(fen)(fen)(fen)子面(mian)積(ji)隨著(zhu)磷(lin)(lin)酸取代(dai)度的(de)(de)增(zeng)加而(er)增(zeng)加，與(yu)之(zhi)前的(de)(de)觀(guan)(guan)察(cha)(cha)結(jie)果(guo)一致。29然而(er)，盡管(guan)單(dan)磷(lin)(lin)酸鹽(yan)PI（4）P與(yu)二磷(lin)(lin)酸鹽(yan)PIP2表現(xian)出(chu)(chu)相(xiang)同的(de)(de)趨勢，但(dan)PI和(he)PI（4）P均未(wei)表現(xian)出(chu)(chu)對NaCl濃度增(zeng)加的(de)(de)顯著(zhu)擴張，表明類似(si)但(dan)小得多的(de)(de)影響(xiang)（圖2b）。這些(xie)數據表明，NaCl誘導PIP2單(dan)分(fen)(fen)(fen)子膜擴張的(de)(de)機制與(yu)其他(ta)陰離子以(yi)及其他(ta)肌(ji)醇(chun)基脂質(zhi)相(xiang)比(bi)，是(shi)PIP2特有的(de)(de)。

與其(qi)他陰離子(zi)磷脂相比，除了NaCl對(dui)(dui)PIP2的(de)(de)擴張(zhang)效應具有特異(yi)(yi)性外，該效應還依賴于PIP2異(yi)(yi)構體。對(dui)(dui)肌醇環（3和(he)5、4和(he)5、3和(he)4）上不(bu)同位置被(bei)取代的(de)(de)合成(cheng)PIP2類(lei)似物的(de)(de)分(fen)子(zi)面積進(jin)行量化表明(ming)，分(fen)子(zi)面積不(bu)僅取決于磷酸(suan)鹽(yan)的(de)(de)位置，而且NaCl誘導(dao)膨脹的(de)(de)大小(xiao)也受磷酸(suan)單(dan)酯在三種(zhong)不(bu)同異(yi)(yi)構體中的(de)(de)位置的(de)(de)影響（圖(tu)5a）。對(dui)(dui)這種(zhong)膨脹的(de)(de)直接(jie)比較表明(ming)，對(dui)(dui)于PI（3,5）P2，0和(he)250 mM NaCl之(zhi)間的(de)(de)差(cha)異(yi)(yi)最大(～22?），然(ran)后是PI（4,5）P2（11?2）和(he)PI（3,4）P2（5?2），并且PIP2異(yi)(yi)構體之(zhi)間的(de)(de)差(cha)異(yi)(yi)在統計學上非常(chang)顯著（p<0.001）。

圖5：。亞(ya)(ya)相氯化(hua)鈉膨脹效(xiao)應(ying)的(de)(de)PIP2異(yi)構(gou)體(ti)特異(yi)性(xing)。（A）HEPES緩沖(chong)亞(ya)(ya)相上的(de)(de)DO-PIP2異(yi)構(gou)體(ti)在(zai)(zai)π）30 mN/m時(shi)的(de)(de)每分(fen)子面積。平均(jun)值（SE，n）7。（B）250 mM NaCl和無(wu)亞(ya)(ya)相NaCl之間DOPIP2異(yi)構(gou)體(ti)的(de)(de)每分(fen)子面積差異(yi)。通過(guo)雙(shuang)向ANOVA測量，NaCl效(xiao)應(ying)的(de)(de)異(yi)構(gou)體(ti)依賴性(xing)顯著(zhu)達到p）0.0001。（C）PIP2分(fen)子間相互作用的(de)(de)概念動畫。在(zai)(zai)沒有潮(chao)向性(xing)試(shi)劑(ji)（綠色橢圓）的(de)(de)情況下(xia)，PIP2分(fen)子形成水介導(dao)的(de)(de)氫鍵網絡(luo)。當添加潮(chao)向性(xing)聚(ju)合物(wu)時(shi)，網絡(luo)被(bei)破壞，帶電磷酸鹽(yan)之間的(de)(de)靜電排(pai)斥導(dao)致單層的(de)(de)膨脹。

不同(tong)反(fan)離(li)(li)子(zi)的(de)(de)影(ying)響。為了(le)確定(ding)單(dan)(dan)(dan)價(jia)鹽(yan)對PIP2單(dan)(dan)(dan)分(fen)子(zi)膜的(de)(de)擴張效(xiao)(xiao)應的(de)(de)離(li)(li)子(zi)特異性，測試了(le)其(qi)他(ta)陽(yang)離(li)(li)子(zi)反(fan)離(li)(li)子(zi)的(de)(de)效(xiao)(xiao)應。在(zai)250 mM時，所(suo)有測試的(de)(de)單(dan)(dan)(dan)價(jia)陽(yang)離(li)(li)子(zi)（Na+、K+、Li+、Cs+）顯示出(chu)類(lei)似(si)的(de)(de)、統(tong)計上顯著的(de)(de)PIP2單(dan)(dan)(dan)分(fen)子(zi)膜擴展，其(qi)影(ying)響程(cheng)度與離(li)(li)子(zi)的(de)(de)電荷密(mi)度直接相關(guan)，即Li+>Na+>K+≈Cs+（圖3a，p）0.15-0.3，因為數據集(ji)有限(xian)，離(li)(li)子(zi)之間的(de)(de)差異）。這里觀(guan)(guan)察(cha)到的(de)(de)電荷密(mi)度依賴性不同(tong)于鹽(yan)誘(you)導的(de)(de)低電荷陰離(li)(li)子(zi)磷脂單(dan)(dan)(dan)分(fen)子(zi)膜的(de)(de)膨(peng)(peng)脹(zhang)，在(zai)鹽(yan)誘(you)導下，沒有觀(guan)(guan)察(cha)到陽(yang)離(li)(li)子(zi)依賴性或(huo)相反(fan)的(de)(de)趨(qu)勢。30與PG相比，不同(tong)陽(yang)離(li)(li)子(zi)引起(qi)的(de)(de)PIP2膨(peng)(peng)脹(zhang)的(de)(de)幅(fu)度30似(si)乎與描述離(li)(li)子(zi)潮向性的(de)(de)Hofmeister級數直接相關(guan)（參考文獻31）。這一結果表(biao)明，除了(le)對頭(tou)基(ji)質子(zi)化(hua)產生影(ying)響外，這些離(li)(li)子(zi)還可能破壞單(dan)(dan)(dan)分(fen)子(zi)層內(nei)多分(fen)子(zi)水介導氫鍵(jian)網絡的(de)(de)結構。

圖(tu)3：。各種反離子的(de)影(ying)響(xiang)。（A）用(yong)250 mM鹽(yan)緩(huan)沖HEPES亞(ya)相(xiang)上的(de)L-R PIP2在π）30 mN/m處的(de)每分子面積；平(ping)均值（SE，n）5。（B）π-L-R PIP2 HEPES緩(huan)沖亞(ya)相(xiang)的(de)面積等溫線，pH 7.4，30°C（實線），相(xiang)同(tong)條件加250 mM CaCl2（虛線）；（插(cha)圖(tu)）250 mM CaCl2和(he)MgCl2影(ying)響(xiang)的(de)量化；平(ping)均值（SE，n）4。

與(yu)單價(jia)鹽(yan)相比，二(er)價(jia)反離子對PIP2的(de)影響非常不同。CaCl2和(he)MgCl2對純PIP2單分(fen)子膜都有很大的(de)冷凝作用（圖3b）。圖3b中的(de)代表(biao)性等溫線突出了這些(xie)差異，包括π）30 mN/m和(he)較低表(biao)面壓力下每(mei)PIP2的(de)面積。插圖顯示了二(er)價(jia)陽(yang)離子凝聚(ju)效應的(de)量(liang)化，并表(biao)明含有250 mM Ca2+和(he)Mg2+的(de)PIP2單分(fen)子膜分(fen)別(bie)比對照壓縮(suo)了15%和(he)9%。這些(xie)結果與(yu)已知的(de)Ca2+作為PIP2交聯劑的(de)能力一(yi)致，Ca2+以(yi)高親和(he)力結合和(he)脫(tuo)水多種磷(lin)酸鹽(yan)，32,33中和(he)其(qi)電荷，橋聯頭基以(yi)形成(cheng)緊(jin)密凝聚(ju)的(de)單分(fen)子膜，34即使在低表(biao)面壓力下也(ye)是如此。

非(fei)離(li)(li)子液晶和(he)溫(wen)度的(de)(de)(de)(de)(de)(de)膨脹(zhang)效應(ying)。為了(le)驗(yan)證單(dan)(dan)價鹽(yan)破(po)壞PIP2頭(tou)基之間有(you)吸引力(li)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)氫鍵(jian)相(xiang)互作用(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)假設(she)，部分克服了(le)高頭(tou)基電荷密度預期的(de)(de)(de)(de)(de)(de)靜電排(pai)斥作用(yong)，測試(shi)了(le)幾種(zhong)非(fei)離(li)(li)子超嗜性(xing)(xing)因(yin)子破(po)壞這些假定(ding)網絡和(he)誘導單(dan)(dan)層膨脹(zhang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)能力(li)。尿(niao)素(su)是一(yi)種(zhong)因(yin)其潮(chao)向性(xing)(xing)而常(chang)用(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)蛋白質(zhi)變性(xing)(xing)劑，海藻糖是一(yi)種(zhong)非(fei)還原性(xing)(xing)葡(pu)萄糖二聚體，因(yin)其破(po)壞水結構(gou)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)能力(li)而具有(you)低(di)溫(wen)保護特(te)性(xing)(xing)，對(dui)其對(dui)PIP2單(dan)(dan)層的(de)(de)(de)(de)(de)(de)影響進行了(le)測試(shi)。與(yu)通過氫鍵(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)吸引相(xiang)互作用(yong)相(xiang)一(yi)致，兩種(zhong)非(fei)離(li)(li)子超取向對(dui)單(dan)(dan)分子膜(mo)都有(you)很強(qiang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)膨脹(zhang)效應(ying)。在(zai)(zai)π）30 mN/m時，5 m尿(niao)素(su)使每個PIP2分子的(de)(de)(de)(de)(de)(de)面(mian)積(ji)增加了(le)近(jin)25%，達到90.9?2/分子，這是在(zai)(zai)這些實驗(yan)中所(suo)采用(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)任何條(tiao)件下觀察到的(de)(de)(de)(de)(de)(de)最高值（圖4b）。同(tong)樣，5 mM海藻糖顯著增加PIP2單(dan)(dan)層的(de)(de)(de)(de)(de)(de)面(mian)積(ji)9%。這些作用(yong)對(dui)PIP2有(you)特(te)異性(xing)(xing)，因(yin)為兩種(zhong)處理對(dui)PI的(de)(de)(de)(de)(de)(de)單(dan)(dan)層都沒有(you)顯著影響。

圖4：。水介導分子(zi)間(jian)氫鍵的(de)(de)證據。HEPES緩沖亞相(xiang)上的(de)(de)L-R PIP2和L-R PI在π）30 mN/m時的(de)(de)每(mei)分子(zi)面(mian)積，pH 7.4（A）存在5 mM海藻(zao)糖和5 m尿素，（B）作為亞相(xiang)（O）PIP2溫度(du)的(de)(de)函(han)數(shu)；0）PI）。

最后，為(wei)了(le)(le)驗證氫鍵(jian)假設，對(dui)PIP2單分(fen)(fen)子(zi)膜(mo)的(de)(de)(de)溫(wen)(wen)(wen)度(du)(du)(du)依(yi)賴性行(xing)為(wei)進行(xing)了(le)(le)測試(shi)。隨著亞相溫(wen)(wen)(wen)度(du)(du)(du)從(cong)34°C降至(zhi)17°C，這(zhe)(zhe)些單層顯示(shi)出非常顯著的(de)(de)(de)收縮(suo)，每(mei)個分(fen)(fen)子(zi)的(de)(de)(de)面積減少了(le)(le)近50%（圖(tu)4a）。相反(fan)，PI的(de)(de)(de)單層僅(jin)收縮(suo)～在(zai)(zai)相同(tong)溫(wen)(wen)(wen)度(du)(du)(du)范(fan)圍內(nei)為(wei)10%，與(yu)kBT壓(ya)(ya)力(li)的(de)(de)(de)簡(jian)單縮(suo)放一(yi)致。雖然由(you)于(yu)脂(zhi)質動能(neng)(neng)(neng)(neng)的(de)(de)(de)降低(di)，預計會出現一(yi)些收縮(suo)，但PIP2的(de)(de)(de)50%差異(yi)強烈表(biao)明了(le)(le)另(ling)一(yi)種機制，如(ru)子(zi)相的(de)(de)(de)熱(re)能(neng)(neng)(neng)(neng)增(zeng)加會破(po)壞氫鍵(jian)網(wang)絡。純PIP2在(zai)(zai)亞相溫(wen)(wen)(wen)度(du)(du)(du)以(yi)下(xia)(xia)不能(neng)(neng)(neng)(neng)形(xing)成壓(ya)(ya)縮(suo)單分(fen)(fen)子(zi)膜(mo)～15°C，相反(fan)，在(zai)(zai)相對(dui)較低(di)的(de)(de)(de)表(biao)面壓(ya)(ya)力(li)下(xia)(xia)（小(xiao)于(yu)10 mN/m；數據未顯示(shi)）出現坍(tan)塌。這(zhe)(zhe)一(yi)結(jie)果可(ke)能(neng)(neng)(neng)(neng)與(yu)理解(jie)溫(wen)(wen)(wen)度(du)(du)(du)誘導的(de)(de)(de)細(xi)胞結(jie)構(gou)變(bian)化(hua)有(you)關，例如(ru)血小(xiao)板的(de)(de)(de)冷(leng)激活，在(zai)(zai)此過程中，質膜(mo)上PIP2組織的(de)(de)(de)變(bian)化(hua)觸發肌動蛋白(bai)組裝(zhuang)。35 PIP2在(zai)(zai)低(di)溫(wen)(wen)(wen)下(xia)(xia)無(wu)法保持平面狀(zhuang)態也可(ke)能(neng)(neng)(neng)(neng)與(yu)在(zai)(zai)4°C下(xia)(xia)溶解(jie)的(de)(de)(de)細(xi)胞膜(mo)耐去污劑部(bu)分(fen)(fen)中存(cun)在(zai)(zai)PIP2有(you)關，14通常與(yu)脂(zhi)筏有(you)關。因此，從(cong)低(di)于(yu)15°C的(de)(de)(de)結(jie)果中無(wu)法推斷(duan)在(zai)(zai)較高(gao)溫(wen)(wen)(wen)度(du)(du)(du)下(xia)(xia)富含(han)膽固(gu)醇的(de)(de)(de)結(jie)構(gou)域中存(cun)在(zai)(zai)PIP2。

討論

多磷(lin)酸肌醇是一種(zhong)重要的(de)(de)(de)(de)信號中間(jian)產(chan)物(wu)(wu)(wu)，但人們(men)對產(chan)生(sheng)或降(jiang)解這(zhe)些(xie)脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)酶(mei)的(de)(de)(de)(de)遺傳調節和表達的(de)(de)(de)(de)了(le)解要比(bi)決定這(zhe)些(xie)脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)在(zai)(zai)(zai)質(zhi)(zhi)(zhi)膜(mo)內分布或在(zai)(zai)(zai)不同細胞間(jian)轉運的(de)(de)(de)(de)物(wu)(wu)(wu)理(li)化學(xue)的(de)(de)(de)(de)了(le)解多得(de)多。由于它(ta)們(men)帶有很(hen)大的(de)(de)(de)(de)負電荷，人們(men)似乎普遍認(ren)為，這(zhe)些(xie)脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)在(zai)(zai)(zai)雙層(ceng)平面內僅表現出相(xiang)互排斥的(de)(de)(de)(de)相(xiang)互作(zuo)用，除非(fei)它(ta)們(men)與特定的(de)(de)(de)(de)蛋(dan)白質(zhi)(zhi)(zhi)絡合(he)，否則會使它(ta)們(men)分散。20,23,36一些(xie)證據表明，PPI在(zai)(zai)(zai)產(chan)生(sheng)洗滌(di)劑不溶性脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)組分的(de)(de)(de)(de)條(tiao)件下被強烈隔離（通常(chang)被視為PPI定位于脂(zhi)筏的(de)(de)(de)(de)證據14），而(er)使用熒光能量(liang)轉移(yi)方法(fa)的(de)(de)(de)(de)研究提供了(le)氫(qing)鍵(jian)可能穩定富含PPI的(de)(de)(de)(de)簇(cu)合(he)物(wu)(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)證據。24,25在(zai)(zai)(zai)這(zhe)種(zhong)情況下，目前的(de)(de)(de)(de)結果提供了(le)PPI之間(jian)靜電相(xiang)互作(zuo)用大小的(de)(de)(de)(de)定量(liang)估計，并表明由氫(qing)鍵(jian)介導的(de)(de)(de)(de)吸引相(xiang)互作(zuo)用顯著抵消了(le)靜電排斥。

用純靜(jing)電(dian)(dian)(dian)機制很好(hao)地解釋了PIP2的(de)(de)壓力-面積(ji)等溫線的(de)(de)一個特征是單價(jia)離(li)(li)子(zi)對表面壓力的(de)(de)一般影響。盡(jin)管單價(jia)鹽在(zai)PIP2單分子(zi)膜(mo)亞(ya)相(xiang)中(zhong)的(de)(de)膨(peng)脹效(xiao)應可能與頭(tou)基之(zhi)間(jian)的(de)(de)靜(jing)電(dian)(dian)(dian)排(pai)斥作用不一致（亞(ya)相(xiang)離(li)(li)子(zi)可能會屏蔽陰離(li)(li)子(zi)頭(tou)基，并允許更緊密的(de)(de)填(tian)充37,38），但亞(ya)相(xiang)陽離(li)(li)子(zi)導致的(de)(de)單分子(zi)膜(mo)膨(peng)脹是由(you)于磷酸(suan)(suan)單酯電(dian)(dian)(dian)離(li)(li)電(dian)(dian)(dian)位對離(li)(li)子(zi)強度的(de)(de)依賴性，先前顯示(shi)磷脂酸(suan)(suan)單層。39這種(zhong)效(xiao)應在(zai)調節(jie)荷電(dian)(dian)(dian)單分子(zi)膜(mo)的(de)(de)凝(ning)膠-液(ye)體轉變溫度方面很重要，40盡(jin)管亞(ya)相(xiang)鹽與其(qi)他陰離(li)(li)子(zi)脂質的(de)(de)膨(peng)脹效(xiao)應測量(liang)值遠(yuan)小(xiao)于此處觀察到的(de)(de)PIP2膨(peng)脹效(xiao)應。30

最近，通(tong)過(guo)將(jiang)系(xi)統(tong)建模(mo)為可(ke)電(dian)(dian)離(li)(li)(li)(li)基(ji)團的(de)(de)(de)均(jun)勻分(fen)(fen)布平面，確定了(le)純(chun)(chun)(chun)靜(jing)(jing)電(dian)(dian)對PIP2單(dan)分(fen)(fen)子(zi)膜表面壓力的(de)(de)(de)貢獻，其電(dian)(dian)荷密(mi)度(du)(du)是可(ke)電(dian)(dian)離(li)(li)(li)(li)基(ji)團pKa和(he)亞相溶液離(li)(li)(li)(li)子(zi)強(qiang)度(du)(du)的(de)(de)(de)函數。41通(tong)過(guo)區分(fen)(fen)熱力學勢(shi)與表面積的(de)(de)(de)關系(xi)計(ji)算出(chu)的(de)(de)(de)靜(jing)(jing)電(dian)(dian)排(pai)斥引起的(de)(de)(de)表面壓力與一(yi)些觀(guan)察(cha)到的(de)(de)(de)實(shi)驗(yan)結果(guo)(guo)定性一(yi)致(zhi)。在中(zhong)性pH下(xia)觀(guan)察(cha)到的(de)(de)(de)膨脹單(dan)分(fen)(fen)子(zi)膜（高達150?2/分(fen)(fen)子(zi)）的(de)(de)(de)高壓可(ke)以(yi)用高電(dian)(dian)荷頭基(ji)的(de)(de)(de)排(pai)斥作用來解(jie)釋(shi)。此外，中(zhong)性pH下(xia)的(de)(de)(de)靜(jing)(jing)電(dian)(dian)模(mo)型證實(shi)了(le)具有低離(li)(li)(li)(li)子(zi)強(qiang)度(du)(du)和(he)高離(li)(li)(li)(li)子(zi)強(qiang)度(du)(du)的(de)(de)(de)等溫線之間的(de)(de)(de)交叉(cha)以(yi)及由于高離(li)(li)(li)(li)子(zi)強(qiang)度(du)(du)導致(zhi)的(de)(de)(de)單(dan)層膨脹（參考(kao)文(wen)獻41中(zhong)的(de)(de)(de)圖(tu)1a和(he)圖(tu)4b）。然而，許(xu)多實(shi)驗(yan)觀(guan)察(cha)到的(de)(de)(de)結果(guo)(guo)與純(chun)(chun)(chun)靜(jing)(jing)電(dian)(dian)處理不(bu)兼容。具體而言(yan)，不(bu)同(tong)(tong)單(dan)價(jia)離(li)(li)(li)(li)子(zi)的(de)(de)(de)不(bu)同(tong)(tong)影響不(bu)能完全通(tong)過(guo)亞相離(li)(li)(li)(li)子(zi)強(qiang)度(du)(du)的(de)(de)(de)變化(hua)(hua)來解(jie)釋(shi)。NaCl誘(you)導的(de)(de)(de)單(dan)層擴張的(de)(de)(de)PIP2異構體特異性以(yi)及不(bu)帶電(dian)(dian)的(de)(de)(de)潮(chao)向(xiang)性和(he)溫度(du)(du)的(de)(de)(de)影響也表明了(le)比(bi)表觀(guan)頭基(ji)pKa的(de)(de)(de)嚴格靜(jing)(jing)電(dian)(dian)亞相離(li)(li)(li)(li)子(zi)強(qiang)度(du)(du)調(diao)制(zhi)更復雜(za)的(de)(de)(de)分(fen)(fen)子(zi)機制(zhi)。此外，pH值(zhi)為1.8時亞相鹽的(de)(de)(de)膨脹效(xiao)應（圖(tu)1b）與預測在所(suo)有磷酸(suan)單(dan)酯質子(zi)化(hua)(hua)的(de)(de)(de)條件下(xia)沒有靜(jing)(jing)電(dian)(dian)效(xiao)應的(de)(de)(de)模(mo)型不(bu)一(yi)致(zhi)（參考(kao)文(wen)獻41中(zhong)的(de)(de)(de)圖(tu)4f）。最后，在幾乎所(suo)有情(qing)況下(xia)，實(shi)驗(yan)測定的(de)(de)(de)PIP2表面壓力明顯低于純(chun)(chun)(chun)靜(jing)(jing)電(dian)(dian)效(xiao)應保(bao)守估計(ji)的(de)(de)(de)預測值(zhi)。

上述實驗(yan)(yan)結(jie)果突(tu)出了(le)吸引(yin)力(li)相(xiang)(xiang)互(hu)(hu)(hu)作(zuo)(zuo)用的(de)(de)(de)重(zhong)(zhong)要性(xing)(xing)(xing)，這種相(xiang)(xiang)互(hu)(hu)(hu)作(zuo)(zuo)用可能(neng)是(shi)由氫(qing)(qing)鍵(jian)(jian)介導(dao)的(de)(de)(de)，可以顯著對抗平面(mian)系(xi)統(tong)中PIP2脂(zhi)質之(zhi)(zhi)(zhi)間(jian)的(de)(de)(de)排(pai)斥(chi)(chi)靜電(dian)相(xiang)(xiang)互(hu)(hu)(hu)作(zuo)(zuo)用。這些(xie)有吸引(yin)力(li)的(de)(de)(de)相(xiang)(xiang)互(hu)(hu)(hu)作(zuo)(zuo)用可能(neng)會被(bei)一(yi)(yi)些(xie)朝潮(chao)性(xing)(xing)(xing)因素(su)(su)(su)破壞(huai)，如單價離(li)子(zi)、海藻(zao)糖或(huo)尿素(su)(su)(su)。這些(xie)發現總(zong)結(jie)在(zai)圖5c所示的(de)(de)(de)定性(xing)(xing)(xing)模型(xing)中。在(zai)沒有干擾(rao)劑(ji)的(de)(de)(de)情況下(xia)，幾(ji)個(ge)(ge)PIP2分(fen)子(zi)通(tong)(tong)過水介導(dao)的(de)(de)(de)氫(qing)(qing)鍵(jian)(jian)網(wang)絡相(xiang)(xiang)互(hu)(hu)(hu)作(zuo)(zuo)用。當(dang)存在(zai)破壞(huai)水-PIP2相(xiang)(xiang)互(hu)(hu)(hu)作(zuo)(zuo)用的(de)(de)(de)離(li)子(zi)因素(su)(su)(su)或(huo)非(fei)(fei)離(li)子(zi)超取向物時(shi)，氫(qing)(qing)鍵(jian)(jian)被(bei)破壞(huai)，靜電(dian)排(pai)斥(chi)(chi)導(dao)致分(fen)子(zi)面(mian)積增加。該(gai)模型(xing)得到了(le)單價陽離(li)子(zi)對純PIP2單分(fen)子(zi)膜(mo)擴展效應的(de)(de)(de)大小以及尿素(su)(su)(su)和(he)海藻(zao)糖（強非(fei)(fei)離(li)子(zi)向潮(chao)性(xing)(xing)(xing)）的(de)(de)(de)影響的(de)(de)(de)支持。建(jian)議的(de)(de)(de)氫(qing)(qing)鍵(jian)(jian)狀(zhuang)態(tai)和(he)超臨(lin)界(jie)膨脹狀(zhuang)態(tai)之(zhi)(zhi)(zhi)間(jian)的(de)(de)(de)計(ji)算能(neng)量差（對于(yu)250 mM LiCl：?面(mian)積）17.8?2/分(fen)子(zi)（35 mN/m時(shi)）～6 kJ/mol）與每個(ge)(ge)PIP2分(fen)子(zi)約一(yi)(yi)個(ge)(ge)氫(qing)(qing)鍵(jian)(jian)的(de)(de)(de)損(sun)失相(xiang)(xiang)當(dang)。這種能(neng)量與PIP2和(he)MARCKS之(zhi)(zhi)(zhi)間(jian)的(de)(de)(de)多價相(xiang)(xiang)互(hu)(hu)(hu)作(zuo)(zuo)用能(neng)具有相(xiang)(xiang)同的(de)(de)(de)尺(chi)度(～16千(qian)焦/摩爾(er)）。23混合脂(zhi)質系(xi)統(tong)中PIP2頭基之(zhi)(zhi)(zhi)間(jian)存在(zai)分(fen)子(zi)間(jian)氫(qing)(qing)鍵(jian)(jian)的(de)(de)(de)可能(neng)性(xing)(xing)(xing)已在(zai)實驗(yan)(yan)24,25和(he)模擬42中得到證實，本文提供的(de)(de)(de)數據通(tong)(tong)過實驗(yan)(yan)證實了(le)這種可能(neng)性(xing)(xing)(xing)，實驗(yan)(yan)表明(ming)氫(qing)(qing)鍵(jian)(jian)是(shi)PIP2分(fen)子(zi)間(jian)相(xiang)(xiang)互(hu)(hu)(hu)作(zuo)(zuo)用的(de)(de)(de)一(yi)(yi)個(ge)(ge)重(zhong)(zhong)要因素(su)(su)(su)。

溫(wen)(wen)度對PIP2單(dan)分子(zi)膜(mo)(mo)的(de)(de)(de)影響(xiang)也表(biao)明這(zhe)些脂(zhi)(zhi)質之間存在重要的(de)(de)(de)非(fei)靜電(dian)相(xiang)互作用。隨著(zhu)溫(wen)(wen)度的(de)(de)(de)降低，表(biao)面(mian)壓力的(de)(de)(de)顯(xian)著(zhu)下(xia)(xia)(xia)降遠遠大(da)于(yu)其(qi)他(ta)帶電(dian)液(ye)相(xiang)脂(zhi)(zhi)質的(de)(de)(de)下(xia)(xia)(xia)降，并且不簡單(dan)地與熱(re)能(neng)成(cheng)比(bi)例(li)。事(shi)實上，純PIP2單(dan)分子(zi)膜(mo)(mo)在室(shi)溫(wen)(wen)下(xia)(xia)(xia)的(de)(de)(de)穩定(ding)性明顯(xian)低于(yu)37°C，并且不能(neng)在15°C以下(xia)(xia)(xia)形(xing)成(cheng)。PIP2單(dan)分子(zi)膜(mo)(mo)在低溫(wen)(wen)下(xia)(xia)(xia)的(de)(de)(de)崩塌可(ke)能(neng)與假設的(de)(de)(de)PPI在低溫(wen)(wen)下(xia)(xia)(xia)聚(ju)集有(you)關(guan)，被認為會觸發血小板的(de)(de)(de)冷(leng)激(ji)活(huo)和(he)可(ke)能(neng)的(de)(de)(de)其(qi)他(ta)生(sheng)物功能(neng)。35

對于觀察到的(de)(de)(de)亞相鹽(yan)(yan)效應，靜電學(xue)和(he)(he)氫(qing)鍵的(de)(de)(de)另(ling)一種解釋是(shi)，單(dan)價鹽(yan)(yan)嵌入陰離(li)子頭基平(ping)面，在(zai)(zai)磷酸(suan)鹽(yan)(yan)和(he)(he)陽離(li)子之間形成網絡晶(jing)格。這一解釋似乎不太可能，因(yin)為膨脹最大的(de)(de)(de)是(shi)最小(xiao)、最正電的(de)(de)(de)離(li)子（Li+），而隨著離(li)子半徑的(de)(de)(de)增大而減小(xiao)（圖(tu)(tu)3a）。此外，盡管在(zai)(zai)沒有鹽(yan)(yan)的(de)(de)(de)情況下(xia)形成波(bo)紋相可以(yi)產生更壓縮的(de)(de)(de)單(dan)層，但沒有通(tong)過任何等溫線觀察到從(cong)液相到波(bo)紋相的(de)(de)(de)相變(bian)（圖(tu)(tu)1a）。此外，波(bo)紋相僅可能在(zai)(zai)高表面壓力下(xia)形成，而在(zai)(zai)低(di)至5 mN/m的(de)(de)(de)壓力下(xia)，高鹽(yan)(yan)和(he)(he)低(di)鹽(yan)(yan)狀態之間的(de)(de)(de)差異很明顯（圖(tu)(tu)1a）。

有兩條證據表明水在維(wei)持這(zhe)種(zhong)網絡(luo)中的(de)重要性，而不是相(xiang)鄰PIP2分(fen)子(zi)之間的(de)直接氫鍵(jian)。預計不會與磷酸(suan)基團相(xiang)互作(zuo)用的(de)非離(li)子(zi)溶質(zhi)尿(niao)素(su)和海藻糖對PIP2單分(fen)子(zi)膜(mo)具有強烈的(de)擴張(zhang)效應(ying)，這(zhe)可(ke)能(neng)是由(you)于它們破壞(huai)了水結構并隨(sui)后干擾了氫鍵(jian)網絡(luo)（圖4a）。其(qi)次(ci)，二價(jia)陽離(li)子(zi)（Ca2+和Mg2+）誘導的(de)PIP2每(mei)個(ge)分(fen)子(zi)面積的(de)顯著減(jian)少(shao)證實了它們能(neng)夠橋(qiao)接相(xiang)鄰脂(zhi)質(zhi)，從而導致(zhi)界面脫水，并表明盡(jin)管PIP2單分(fen)子(zi)膜(mo)通過氫鍵(jian)能(neng)力保持壓(ya)縮狀態(tai)，它們不像被二價(jia)陽離(li)子(zi)直接交聯(lian)時那(nei)樣被緊密壓(ya)縮（圖3b）。

許多(duo)實驗表明，PIP2的(de)許多(duo)細胞結(jie)(jie)(jie)合(he)(he)伙(huo)伴至少有兩種不同的(de)相互作用(yong)(yong)模(mo)式。一些(xie)蛋白質（例(li)如，含有PH結(jie)(jie)(jie)構(gou)域的(de)蛋白質）對單個(ge)PIP2分(fen)子有一個(ge)特定的(de)結(jie)(jie)(jie)合(he)(he)位點(dian)，43–45，而其他蛋白質則含有非結(jie)(jie)(jie)構(gou)化的(de)多(duo)元酸結(jie)(jie)(jie)構(gou)域，被認(ren)為可(ke)(ke)以通(tong)過(guo)非特異性靜電(dian)(dian)吸引同時結(jie)(jie)(jie)合(he)(he)多(duo)個(ge)PIP2分(fen)子（例(li)如，MARCKS23,46）。考慮到細胞可(ke)(ke)能通(tong)過(guo)影響氫鍵和靜電(dian)(dian)排斥之(zhi)間的(de)平衡(heng)來調節(jie)PIP2介導(dao)的(de)信(xin)號傳(chuan)導(dao)，從而調節(jie)可(ke)(ke)用(yong)(yong)于單個(ge)脂質結(jie)(jie)(jie)合(he)(he)蛋白域的(de)PIP2池(chi)與可(ke)(ke)用(yong)(yong)于結(jie)(jie)(jie)合(he)(he)多(duo)分(fen)子組裝的(de)PIP2池(chi)，這似乎是合(he)(he)理的(de)。

確認。這項(xiang)工(gong)作得到(dao)了MRSEC第05-20020號贈(zeng)款（I.L.和P.A.J.）和富布賴特基金會（A.C.）的資助。