材料和方法

化學品

煤油(you)和正十六烷 (99%) 是(shi) Alfa Aesar (Karlsruhe, Germany) 的產(chan)品(pin)。 菜籽油(you)購自超市。 原油(you)由 ENI Norge 提供。 苯并(bing) (a) 芘粉末(mo) (>96%) 和苯并(bing) (a) 芘溶液（100 ng/μl 的環己(ji)烷溶液）購自 Sigma Aldrich（美國密(mi)蘇(su)里州）。 溶劑甲基叔丁基醚 (MTBE)、庚烷和環己(ji)烷是(shi) Merck KGaA（德國達姆施(shi)塔特）的產(chan)品(pin)。 除非另有說明(ming)，否(fou)則(ze)所用化(hua)學品(pin)均為分(fen)析級。

沙子和海水樣品

從沿(yan)挪威海(hai)岸線(xian)（包括朗(lang)格(ge)松(song)、赫瓦勒(le)、Tj?me、羅(luo)弗敦和奧(ao)斯陸(lu)港）的(de)歷史石油烴(jing)污染地點收集的(de)沙(sha)子/土壤樣本和海(hai)水用于(yu)分離烴(jing)降解細菌。

媒體

將(jiang)微生(sheng)物維(wei)持在(zai) Marine Agar 2216 (Difco) 或(huo) Marine Broth 2216 (Difco) 上。 煤油或(huo)其他特定碳(tan)源(yuan)上的(de)細菌生(sheng)長在(zai)改良(liang)的(de) Bushnell Haas (MBH) 培養基上進行，該(gai)培養基含有（在(zai) 1 升海水中）： KH2PO4，（1 克(ke)(ke)）； K2HPO4，（1 克(ke)(ke)）； NH4NO3，（1 克(ke)(ke)）； MgSO4·7H2O（0.2克(ke)(ke)）； CaCl2·2H2O（0.02克(ke)(ke)）； FeCl3·6H2O（0.05 克(ke)(ke)）。[11]

烴類降解菌的分離

通過(guo) 0.2 μm 過(guo)濾(lv)(lv)器(qi)無菌(jun)過(guo)濾(lv)(lv) 400 ml 的(de)海(hai)(hai)水。 然后(hou)將過(guo)濾(lv)(lv)器(qi)放入 250 毫升錐形燒(shao)瓶(ping)中，該(gai)燒(shao)瓶(ping)中預裝了 50 毫升 MBH 肉湯。 對于土壤/沙子(zi)樣品，使用 5 克土壤/沙子(zi)。 根(gen)據污染場(chang)地(di)，補充(chong) 1% (w/w) 的(de)過(guo)濾(lv)(lv)滅菌(jun)柴油(you)或原油(you)作為碳和能(neng)源(yuan)。 然后(hou)將接種的(de)燒(shao)瓶(ping)在(zai) 13°C、160 rpm 下培養 3 周，并在(zai)相(xiang)同(tong)培養基中傳代培養兩次(ci)。 隨后(hou)將第三次(ci)富集培養物在(zai) MBH 中稀(xi)釋到適當(dang)的(de)稀(xi)釋度，并鋪在(zai)海(hai)(hai)洋(yang)瓊(qiong)脂 2216 上。這(zhe)產生了 84 個具有不同(tong)形態(tai)的(de)菌(jun)落。 選(xuan)擇不同(tong)的(de)菌(jun)落并再次(ci)在(zai)海(hai)(hai)洋(yang)瓊(qiong)脂 2216 上劃線以(yi)獲得純培養物。

篩選表面活性特性

從(cong)斯瓦爾(er)巴群島海灘沉積(ji)物(wu)(wu)中分(fen)離(li)出(chu)的(de)(de)(de)能夠利用煤油作為碳源(yuan)和(he)能源(yuan)的(de)(de)(de)挪威漁業科(ke)學(xue)學(xue)院(yuan)培養(yang)物(wu)(wu)保藏中心的(de)(de)(de) 93 株新的(de)(de)(de)碳氫化合物(wu)(wu)降解菌株與(yu)(yu) 93 株菌株一起篩選了 SAC 生產能力(li)。 菌株在(zai)海洋(yang)瓊脂(zhi)平板上(shang)于 13°C 培養(yang) 1 周。 隨后將(jiang)每種(zhong)分(fen)離(li)物(wu)(wu)的(de)(de)(de)單菌落接種(zhong)在(zai)試(shi)管中，加入 3 ml MBH 培養(yang)基并補充有 1% (w/w) 葡(pu)萄糖(tang)或煤油。 將(jiang)管在(zai) 13°C (180 rpm) 下(xia)用葡(pu)萄糖(tang)培養(yang) 1 周，用煤油培養(yang) 4 周。 通(tong)過離(li)心（10,000 rpm 10 分(fen)鐘）將(jiang)細(xi)胞與(yu)(yu)培養(yang)液分(fen)離(li)。 對完(wan)整培養(yang)物(wu)(wu)和(he)無細(xi)胞上(shang)清(qing)液進行(xing)生物(wu)(wu)表面活性劑和(he)乳化特性的(de)(de)(de)測定，如(ru)下(xia)所述。

SAC 生產的光學畸變測定

從每(mei)個菌株的(de)培養上(shang)清液中取出 100 μl 體積并(bing)加(jia)入到平(ping)底(di) 96 微(wei)孔板(ban)中。 然后將這些板(ban)放在(zai)一張帶(dai)有黑色網格的(de)紙(zhi)上(shang)并(bing)進行檢查。 網格的(de)光學畸變為(wei) SAC 的(de)存在(zai)提供了定性分析。 [12]

用于 SAC 生產的油擴散試驗

將(jiang)蒸餾(liu)(liu)水(shui) (3 ml) 裝入 24 孔微孔板的每(mei)個孔中(zhong)。 將(jiang) 10 μl 原油(you)加(jia)入蒸餾(liu)(liu)水(shui)中(zhong)，并將(jiang)約(yue) 10 μl 細菌(jun)培養物(wu)逐漸加(jia)入油(you)層中(zhong)心。 如(ru)果培養物(wu)中(zhong)存(cun)在 SAC，則油(you)將(jiang)被置換并形成(cheng)清潔區。 還包(bao)括分別使(shi)用 10 μl 蒸餾(liu)(liu)水(shui)和(he) 10 μl Tween 80 (0.1% w/w) 的陰性(xing)和(he)陽性(xing)對照。 [13]

乳化試驗

如 Batista 等人所述(shu)測(ce)量無(wu)細胞(bao)上清(qing)(qing)液(ye)的(de)乳(ru)化(hua)活性(xing)。 [14]。 選擇在(zai)初(chu)始定(ding)性(xing)篩(shai)選中產生穩(wen)定(ding)混濁乳(ru)液(ye)層的(de)上清(qing)(qing)液(ye)進行定(ding)量乳(ru)化(hua)測(ce)定(ding)，在(zai)試管（φ 13 mm × 16 mm）中使用(yong) 5 ml 上清(qing)(qing)液(ye)和 5 ml 煤(mei)油(you)。 然后(hou)將混合物渦旋2分鐘并在(zai)室溫下靜(jing)置(zhi)。 24 小時(shi)后(hou)估計相(xiang)對乳(ru)液(ye)體積 (EV %) 與總液(ye)體體積。

表面張力和臨界膠束濃度 (CMC) 測量

根據 Du Nouy 方法，使用(yong) EZ-Piplus 張力(li)計（Kibron，芬蘭）測量(liang)(liang)培(pei)養物和(he)培(pei)養物上清(qing)液的(de)表(biao)(biao)面張力(li)。 [15] 提(ti)取的(de) SAC（見下文）重新懸浮在(zai)蒸餾(liu)水中并稀(xi)釋到不同的(de)濃度。 測量(liang)(liang)稀(xi)釋液的(de)表(biao)(biao)面張力(li)以確定(ding)CMC。 CMC 是表(biao)(biao)面張力(li)值達到最低水平時 SAC 的(de)最低濃度。

生物表面活性劑的生產和提取

SAC 陽性菌(jun)株在(zai) 50 ml 海洋(yang)肉(rou)湯中(zhong)預培(pei)養(yang) 24 小時(shi)。 然(ran)后通過在(zai) 5°C 下以(yi) 4500 rpm 離心 20 分鐘(zhong)收(shou)獲細(xi)胞(bao)，并用 MBH 培(pei)養(yang)基洗(xi)滌(di) 3 次。 將細(xi)胞(bao)沉淀(dian)重新懸浮在(zai) 100 ml MBH 培(pei)養(yang)基中(zhong)，該培(pei)養(yang)基補充有 2% (w/w) 過濾(lv)滅(mie)菌(jun)的煤油、正十六烷或高壓滅(mie)菌(jun)的菜籽油。 將燒瓶在(zai)旋轉振蕩(dang)器(qi)中(zhong)以(yi) 160 rpm 在(zai) 20°C 下孵育 7 天。

為了在(zai)靜息細胞(bao)條件(jian)下(xia)生產(chan) SAC，將(jiang)細菌(jun)分離物在(zai) 50 ml 海洋肉湯(tang)中預培養(yang) 24 小(xiao)時(shi)。 然后通過在(zai) 5°C 下(xia)以 4500 rpm 離心(xin) 20 分鐘(zhong)收獲培養(yang)物，并用含(han)有(you) K2HPO4 1 g 的磷酸鹽緩(huan)沖(chong)(chong)液(ye)洗滌 3 次； KH2PO4 1 g 和 NaCl 19.7 g。 將(jiang)細胞(bao)沉(chen)淀（0.6 g）重新(xin)懸浮在(zai)補充(chong)有(you) 2% (w/w) 過濾滅菌(jun)煤油的 50 ml 磷酸鹽緩(huan)沖(chong)(chong)液(ye)中，隨后將(jiang)細胞(bao)懸浮液(ye)在(zai) 160 rpm 和 20°C 下(xia)孵育 5 天(tian)。

根據 Kuyukina 等人的(de)方法提取生物表面活性劑。 [16] 稍(shao)作修(xiu)改。 將等體積的(de) MTBE 添(tian)加(jia)到培養(yang)物中(zhong)。 將混合物在(zai) 45 kHz 下超聲(sheng) 5 分(fen)鐘，隨后在(zai)旋(xuan)轉振(zhen)蕩器上以 200 rpm、20°C 振(zhen)蕩 3 小時，然后在(zai) 4°C 下以 4500 rpm 離心 5 分(fen)鐘以分(fen)離兩相。 將頂部溶劑層轉移(yi)到干凈的(de)燒(shao)杯中(zhong)并(bing)在(zai) 37°C 下干燥。

16S rRNA基因序列分析

選定的(de)(de)分離株在 16°C 下在海洋肉湯中培養 24 小時(shi)。 對于 16S rRNA 基(ji)因(yin)擴增，使(shi)用(yong) InstaGene 矩陣(zhen)試劑盒(he)（Bio-Rad，英國）按照制造商的(de)(de)說明分離細菌染色體 DNA。 16S rRNA 基(ji)因(yin)使(shi)用(yong) PCR 方法用(yong) 1 U Taq DNA 聚合酶 (VWR) 和通用(yong)引物 27F (5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) 和 1492R (5' -TACGGYTACCTTGTTACGACTT) 進(jin)行擴增。 根據制造商的(de)(de)方案，使(shi)用(yong) BigDye 終(zhong)止子試劑盒(he) 3.1 版(ban)（Applied Biosystems）對 16S rRNA 基(ji)因(yin)進(jin)行測(ce)序，使(shi)用(yong)通用(yong)引物 515F（5' -GTGCCAGCAGCCGCGGTAA）。 PCR 測(ce)序后，使(shi)用(yong) Applied Biosystems 3130xl 基(ji)因(yin)分析儀對樣品進(jin)行測(ce)序。 使(shi)用(yong) RDP (//rdp.cme.msu.edu) 提(ti)供(gong)的(de)(de) SEQMATCH 程(cheng)序進(jin)行分類學(xue)分類。 使(shi)用(yong)國家生物技(ji)術(shu)信息(xi)中心 (NCBI) 的(de)(de) BLAST 2.2.12 版(ban)檢查序列同源性。 16S rRNA 基(ji)因(yin)序列以(yi)登錄號提(ti)交給 GenBank。

正十六烷的生物降解

來自紅球菌屬(shu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)生(sheng)物(wu)(wu)表(biao)(biao)面(mian)活性(xing)劑。 研究了(le)菌株(zhu) LF-22 對正(zheng)十(shi)六(liu)烷(wan)生(sheng)物(wu)(wu)降解的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)影響。 將(jiang)過濾除菌的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)正(zheng)十(shi)六(liu)烷(wan) (1 ml) 添(tian)加(jia)到(dao) 100 ml 高(gao)壓滅菌的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)海水(shui)中，并(bing)補充有 KH2PO4 (1 gl-1)； K2HPO4 (1 gl-1 ); NH4NO3 (1 gl-1 ) 和(he)(he) FeCl3·6H2O (0.05 gl-1 )。 將(jiang)提取(qu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)生(sheng)物(wu)(wu)表(biao)(biao)面(mian)活性(xing)劑以終濃度(du)為 CMC 的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)兩倍(bei)添(tian)加(jia)到(dao)燒瓶(ping)中。 Yarrowia spp. 的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)混合酵母培養(yang)物(wu)(wu) LS-DO。 作(zuo)為正(zheng)十(shi)六(liu)烷(wan)降解劑接種(zhong)在燒瓶(ping)中。 LS-DO 能夠利用正(zheng)十(shi)六(liu)烷(wan)和(he)(he)煤油(you)作(zuo)為唯一(yi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)碳源和(he)(he)能源。 樣品(pin) 1 是僅包含正(zheng)十(shi)六(liu)烷(wan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)對照（表(biao)(biao) 4）。 樣品(pin) 2 含有正(zheng)十(shi)六(liu)烷(wan)和(he)(he)生(sheng)物(wu)(wu)表(biao)(biao)面(mian)活性(xing)劑。 樣品(pin) 3 補充有正(zheng)十(shi)六(liu)烷(wan)和(he)(he)耶氏(shi)酵母屬(shu)。 LS-DO。 樣品(pin) 4 與樣品(pin) 3 相似，但添(tian)加(jia)了(le)生(sheng)物(wu)(wu)表(biao)(biao)面(mian)活性(xing)劑。 將(jiang)燒瓶(ping)在 180 rpm、13°C 下(xia)孵育 17 天。 在開(kai)始和(he)(he) 13 天和(he)(he) 17 天后測量(liang)培養(yang)物(wu)(wu)在 600 nm 處的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)光密度(du)、表(biao)(biao)面(mian)張力和(he)(he)培養(yang)物(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)正(zheng)十(shi)六(liu)烷(wan)濃度(du)。 使用分(fen)配重(zhong)量(liang)法測量(liang)培養(yang)物(wu)(wu)中正(zheng)十(shi)六(liu)烷(wan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)濃度(du)。 [17]

海洋細菌中生物表面活性物質——摘要、介紹

海洋細菌中生物表面活性物質——材料和方法

海洋細菌中生物表面活性物質——結果和討論

海洋細菌中生物表面活性物質——結論、致謝！