二、實驗

2.1 材料

二油酰(xian)(xian)磷(lin)脂(zhi)酰(xian)(xian)膽堿(jian) (DOPC)、二棕(zong)櫚酰(xian)(xian)磷(lin)脂(zhi)酰(xian)(xian)絲(si)氨酸 (DPPS)、膽固醇 (Chol)、棕(zong)櫚酰(xian)(xian)鞘磷(lin)脂(zhi) (pSM) 和(he)親脂(zhi)性(xing)熒光探針 La-磷(lin)脂(zhi)酰(xian)(xian)乙醇胺(an)-N-（麗(li)絲(si)胺(an)羅丹明 B 磺酰(xian)(xian)基）（銨 鹽）（雞蛋轉磷(lin)脂(zhi)酰(xian)(xian)化，雞肉）購自(zi) Avanti 極性(xing)脂(zhi)質（阿拉(la)巴斯特，阿拉(la)巴馬州）。

在 Cl3CH/CH3OH 2 : 1 v/v 中制備(bei)脂質混合物(wu) 得(de)到 1 nmol mL 的溶(rong)液？ 1 總濃(nong)度(du)(du)與所有(you) 所使用(yong)的溶(rong)劑(ji)和化學(xue)品(pin)具有(you)最(zui)高的商(shang)業(ye)價值 純度(du)(du)可(ke)用(yong)。 脂質單層和雙層的制備(bei) 并在 (22 ? 1) 1C 的 0.145 M NaCl 亞相上表征 使用(yong)從(cong) Milli-Q 系(xi)統 (Millipore) 獲得(de)的水，18 MO cm。

透(tou)射電子顯微鏡 (TEM) 網(wang)格用于(yu) 組裝獨立的平面雙(shuang)層獲(huo)得 來自 SPI Supplies（美國西切斯特）。

2.2 方法

2.2.1 脂膜觀察。

經(jing)典脂筏混(hun)(hun)合物(wu) 含有飽和(he)(he)(he)脂質、不飽和(he)(he)(he)脂質和(he)(he)(he)膽固(gu)醇 被用來(lai)進(jin)行實驗。 混(hun)(hun)合物(wu) DOPC : pSM (1 : 1) + 25% Chol 和(he)(he)(he) DOPC : DPPS (1:2) + 20% Chol 選擇(ze)用于(yu)中性和(he)(he)(he)帶電域(yu)的(de)實驗， 分別(bie)。 呈現相分離的(de)組合物(wu)是 選擇(ze)的(de)目(mu)的(de)是觀(guan)察和(he)(he)(he)跟蹤領(ling)域(yu) 單層(ceng)和(he)(he)(he)雙層(ceng)的(de)微米尺(chi)寸(cun)。 為了那個(ge)原(yuan)因(yin) 目(mu)的(de)是將(jiang) 1 mol% 的(de)熒光探(tan)針加入到 混(hun)(hun)合物(wu)。 由(you)于(yu)熒光探(tan)針濃度較(jiao)密 相較(jiao)低，液相有序相中的(de)域(yu) (Lo) 在顯(xian)微照片中顯(xian)得(de)更(geng)暗。 富集Lo相 每(mei)種(zhong)混(hun)(hun)合物(wu)中的(de) pSM 和(he)(he)(he) Chol 或 DPPS 和(he)(he)(he) Chol。40-44

脂質單層的制(zhi)備和表征(zheng)使(shi)用(yong) Langmuir 薄(bo)膜天平（微(wei)孔(kong)、Kibron、赫爾辛基、 芬蘭）置于倒(dao)置熒光的舞臺上 顯微(wei)鏡（Axiovert 200，Carl Zeiss，Oberkochen，德國），物鏡為 20、40 或 100。 圖像已注冊 使(shi)用(yong) CCD 攝像機（IxonEM+ 型號(hao) DU-897，Andor 技(ji)術）。

獨(du)立(li)的(de)(de)平面(mian)(mian)脂質雙(shuang)層(ceng)(ceng)是通過(guo)形(xing)成的(de)(de) 使(shi)(shi)用鍍金 TEM 網(wang)格(ge)的(de)(de) Langmuir-Blodgett 轉移 3 毫米直徑，帶(dai)有(you) 200 個(ge)六(liu)(liu)邊形(xing)穿(chuan)孔，每個(ge)穿(chuan)孔 100 毫米。 金表面(mian)(mian)用十(shi)八(ba)烷(wan)(wan)基硫醇修飾 產生疏(shu)水性底物，如前所述。 39,45 在進行(xing)沉積之前，對網(wang)格(ge)進行(xing)了預(yu)處(chu)理(li) 1 mL 4% v/v 十(shi)六(liu)(liu)烷(wan)(wan)的(de)(de)己(ji)烷(wan)(wan)溶(rong)液。 一次(ci)己(ji)烷(wan)(wan) 蒸發，剩余的(de)(de)十(shi)六(liu)(liu)烷(wan)(wan)提供(gong)適當的(de)(de) 雙(shuang)層(ceng)(ceng)形(xing)成的(de)(de)高原-吉(ji)布斯邊界（圓環）。40,46,47 In 這樣，含(han)有(you)所需混合物的(de)(de)單(dan)層(ceng)(ceng)被 壓縮(suo)到 28 mN m? 1 ，然(ran)后表面(mian)(mian)壓力(li)為 在薄膜轉移過(guo)程中保(bao)持(chi)恒(heng)定。 這個(ge)表面(mian)(mian)壓力(li)是 足夠高以實現有(you)效(xiao)的(de)(de)薄膜轉移，以及 低到仍然(ran)存在相分(fen)離，因為臨界 這些混合物在 22 1C 的(de)(de)點接近 33 mN m? 1 . 這 底物通過(guo)脂質界面(mian)(mian)垂直下(xia)(xia)降，并平行(xing)于玻璃底部放(fang)置(zhi) 槽，以便使(shi)(shi)用倒置(zhi)的(de)(de)觀察雙(shuang)層(ceng)(ceng) 顯微鏡。 雙(shuang)層(ceng)(ceng)保(bao)持(chi)在亞(ya)相下(xia)(xia)， 穩(wen)定了幾個(ge)小時(shi)。

實驗裝置允許原位可(ke)(ke)視化 沉積后(hou)的(de)(de)(de)單層(ceng)(ceng)(ceng)和(he)(he)雙(shuang)(shuang)層(ceng)(ceng)(ceng)如(ru)圖(tu)所(suo)示(shi)(shi) 圖(tu) 1A。 單層(ceng)(ceng)(ceng)的(de)(de)(de)代表性(xing)圖(tu)像和(he)(he) 還顯示(shi)(shi)了雙(shuang)(shuang)層(ceng)(ceng)(ceng)。 中(zhong)(zhong)性(xing)單層(ceng)(ceng)(ceng)的(de)(de)(de)顯微照片 圖(tu) 1B 顯示(shi)(shi)了在薄(bo)膜(mo)轉移(yi)(yi)之前。 之后(hou)立馬 其轉移(yi)(yi)，雙(shuang)(shuang)層(ceng)(ceng)(ceng)熒光出(chu)現均勻 （見(jian)圖(tu) 1C），但(dan)在 10-15 分(fen)鐘后(hou)，相分(fen)離 觀察到（圖(tu) 1D 和(he)(he) E）。 這個滯后(hou)時間(jian)(jian)是一(yi)致的(de)(de)(de) 自發變薄(bo)過(guo)程所(suo)需(xu)的(de)(de)(de)時間(jian)(jian) 由(you)于(yu)溶(rong)劑從雙(shuang)(shuang)層(ceng)(ceng)(ceng)中(zhong)(zhong)間(jian)(jian)遷移(yi)(yi)到 支持邊(bian)(bian)界。47,48 一(yi)些雙(shuang)(shuang)層(ceng)(ceng)(ceng)在 當電(dian)網容納時轉移(yi)(yi)或通過(guo)水通量 觀察，可(ke)(ke)以在圖(tu) 1C 的(de)(de)(de)右(you)下角(jiao)觀察到。 此外，中(zhong)(zhong)性(xing)和(he)(he)帶電(dian)雙(shuang)(shuang)層(ceng)(ceng)(ceng)顯示(shi)(shi)在 圖(tu)1D和(he)(he)E分(fen)別。 分(fen)析的(de)(de)(de)區域對應 總是在雙(shuang)(shuang)層(ceng)(ceng)(ceng)的(de)(de)(de)中(zhong)(zhong)心以避免影響 由(you)于(yu)靠近(jin)高(gao)原-吉布斯邊(bian)(bian)界（方形 在圖(tu)1E）。

圖(tu)(tu) 1 用(yong)(yong)于生成和觀察朗(lang)繆爾單(dan)層和平面(mian)獨(du)立雙(shuang)(shuang)層的(de)實(shi)驗裝置 (A)。 代表性(xing)圖(tu)(tu)像顯示(shi)(shi)(shi) 表面(mian)壓力為 28 mN m 的(de)中(zhong)性(xing)朗(lang)繆爾單(dan)層膜？ 1 (B), 轉(zhuan)移后立即(ji)包含(han)多個同質(zhi)雙(shuang)(shuang)層 (C) 的(de)網(wang)格, 和 突(tu)出(chu)顯示(shi)(shi)(shi)的(de)孔（C 中(zhong)的(de)插圖(tu)(tu)）的(de)放(fang)大圖(tu)(tu)，以及顯示(shi)(shi)(shi)相共存的(de)中(zhong)性(xing) (D) 和帶電(dian)雙(shuang)(shuang)層 (E)。 橙色虛線方(fang)塊(kuai) (E) 中(zhong)顯示(shi)(shi)(shi)的(de)是用(yong)(yong)于分析(xi)的(de)區域的(de)示(shi)(shi)(shi)例。

應(ying)該注意的(de)(de)是，用于此(ci)的(de)(de)雙(shuang)層(ceng)域(yu) 研究總是通(tong)過兩個半層(ceng)耦合，并(bing)且僅(jin)在 孤立的(de)(de)案例域(yu)出現(xian)解(jie)耦，如提議(yi)的(de)(de)那(nei)樣 此(ci)域(yu)大小范圍（參(can)見 ESI，? S1）。49 域(yu)間斥力隨著距離的(de)(de)減小而(er)變化 在相似區域(yu)的(de)(de)域(yu)之間，這是通(tong)過 增(zeng)加(jia)液體占(zhan)據的(de)(de)總面(mian)積 ESI? (S2) 中詳述的(de)(de)有序相 (%Lo)。

據我們所知，這是第(di)一(yi)(yi)次，這種(zhong)雙層 在 TEM 網格上(shang)形成的系統用于(yu)查看和(he)研究系統 呈現相分離。 注意優點(dian)之一(yi)(yi) 這個實(shi)驗設置的一(yi)(yi)個特點(dian)是轉(zhuan)移后，雙層是 形成在網格的幾乎(hu)所有孔中(zhong)，允許分析 從單(dan)個實(shi)驗中(zhong)獲(huo)得的多個雙層，以及 改進數據采(cai)集(ji)和(he)統計(ji)。

2.2.2 域跟蹤和擴散測量。

在(zai) 為了(le)獲(huo)得域的擴散系數（D），對 小域（1-3 毫米半徑）在(zai)視(shi)頻(pin)中被跟蹤(zong) 15–20 秒（150–200 幀，每幀 0.1 秒）如所述 50 軟件(jian)程序 Image-J 用于執行 允許(xu)圖(tu)像(xiang)分(fen)割和插件(jian)"Mosaic Suite" 通(tong)過圖(tu)像(xiang)跟蹤(zong)粒子。 51 有關更(geng)多詳細信息 以及獲(huo)得的圖(tu)像(xiang)分(fen)割和軌跡的示例 在(zai)對流阻力下，參見 ESI?（S3 和 S4）。

2.2.3 域和均值的徑向分布函數 力相互作用勢。

徑向(xiang)分布函(han)數(shu)(shu) g(r) 是(shi)為膜(mo)平(ping)面(mian)(mian)上的域計算的 雙層和單層作為數(shu)(shu)量(liang)的函(han)數(shu)(shu) 域，由有序(xu)液(ye)體的面(mian)(mian)積(ji)百分比量(liang)化 相狀態，%Lo。 150幀的視頻分為三(san)個 部分，以及域中心之間(jian)距(ju)離的直方(fang)圖 (r) 使用來自 50 個連續幀的數(shu)(shu)據構建，并且 報告的 g(r) 值(zhi)是(shi)平(ping)均這些直方(fang)圖的結果。

根據上(shang)述(shu)測(ce)定，平均(jun)力勢為 計算依據：

其中(zhong) b 是 (kT)？ 1 和 w(r) 表示(shi)平均力勢 域之間。 52 w(r) 曲線(xian)的(de)第一(yi)(yi)(yi)個谷(gu)（其中(zhong) 對應于 g(r) 曲線(xian)的(de)第一(yi)(yi)(yi)個峰）被擬合為(wei) 二(er)次函數和從它的(de)曲率一(yi)(yi)(yi)個有效的(de)彈(dan)簧 計算常(chang)數，用于量化(hua) 域間交互。

2.2.4 域合并。

以(yi)量化(hua)比率為目的(de)(de) 域的(de)(de)融合，雙層和單層的(de)(de)視頻是 拍(pai)攝 15-30 分(fen)鐘，中(zhong)間間隔(ge) 5 秒 幀。 相(xiang)對于第一張顯(xian)微照片計算(suan)了一段時(shi)間內的(de)(de)域數量，每個(ge)照片平(ping)均 12 張 分(fen)鐘。 這(zhe)些視頻是針對 40%Lo 的(de)(de)膜拍(pai)攝的(de)(de) 所有系統，并在 28 mN m 的(de)(de)固(gu)定表面(mian)壓力下(xia)？ 1 在 朗繆爾(er)單層的(de)(de)情況。 時(shi)間零是在此刻設置的(de)(de) 在雙層情況下(xia)的(de)(de)域外觀，以(yi)及(ji)在點 達(da)到(dao)了單層所需的(de)(de)表面(mian)壓力。

微尺度區域內靜電相互作用力動態調節和脂質雙分子層的分布——摘要、簡介

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