材料和方法

所有(you)溶(rong)液均(jun)使用無熱原(yuan)Milli-Q水（微孔）制備(bei)。 從(cong)西(xi)格瑪化(hua)學公司購(gou)買了(le)HPLC級三苯(ben)醚(mi)、聚氧乙烯基(ji)(ji)-9-月桂基(ji)(ji)醚(mi)、C12（EO）9、二吡啶基(ji)(ji)磷(lin)脂(zhi)酸(suan)（DMPA）、2-氨(an)基(ji)(ji)-2-甲基(ji)(ji)丙烷-1-醇（AMPOL）、對(dui)硝基(ji)(ji)苯(ben)磷(lin)酸(suan)酯（PNPP）和異硫氰酸(suan)熒光素。從(cong)默克公司獲得(de)氯(lv)仿(fang)、甲醇和氯(lv)化(hua)鎂(mei)。 所有(you)其他試(shi)劑均(jun)具有(you)最高的(de)市售純度。

堿(jian)性(xing)(xing)(xing)(xing)磷(lin)酸(suan)酶的(de)(de)(de)制備。 該酶由富含(han)堿(jian)性(xing)(xing)(xing)(xing)磷(lin)酸(suan)酶的(de)(de)(de)大鼠骨板膜制備。37個膜結合堿(jian)性(xing)(xing)(xing)(xing)磷(lin)酸(suan)酶（0.2 mg/mL）樣品在(zai)(zai)25°C條件下(xia)，在(zai)(zai)恒定攪拌(ban)下(xia)，用1%（最終濃(nong)(nong)度）C12-（EO）9（polidocanol）溶(rong)(rong)解2 h。 在(zai)(zai)30000g離心2h后(hou)，將溶(rong)(rong)解洗(xi)滌劑形(xing)式的(de)(de)(de)堿(jian)性(xing)(xing)(xing)(xing)磷(lin)酸(suan)酶（DSAP）濃(nong)(nong)縮在(zai)(zai)YM-5 Amicon過濾器上(shang)，并用5mmol透析過夜 ● L-1 Tris“HCl緩(huan)沖(chong)液(ye)(ye)，pH值7.5，含(han)2 mmol ● L-1 MgCl2，150 mmol ● L-1氯化(hua)鈉和0.01%（v/v）聚二十二烷醇。 最后(hou)，在(zai)(zai)Sephacryl S-300柱（130×1.7cm）上(shang)純(chun)化(hua)DSAP，在(zai)(zai)相同(tong)的(de)(de)(de)緩(huan)沖(chong)液(ye)(ye)中(zhong)平衡和洗(xi)脫。 在(zai)(zai)非變性(xing)(xing)(xing)(xing)條件下(xia)純(chun)化(hua)酶的(de)(de)(de)聚環丙(bing)酰(xian)胺(an)凝膠電泳38顯示出與酶活性(xing)(xing)(xing)(xing)一致的(de)(de)(de)單一蛋白(bai)帶。 在(zai)(zai)均相溶(rong)(rong)液(ye)(ye)中(zhong)PNPP水解時測得的(de)(de)(de)純(chun)化(hua)DSAP的(de)(de)(de)比活性(xing)(xing)(xing)(xing)為(wei)1482.0 nmol的(de)(de)(de)PNP-“min-1”mg-1（PNP-）對硝基苯酚(fen)（PNPP的(de)(de)(de)水解產物），在(zai)(zai)先(xian)前報告的(de)(de)(de)范圍內。39在(zai)(zai)0.01%（v/v）的(de)(de)(de)存在(zai)(zai)下(xia)，將酶保持在(zai)(zai)碎冰中(zhong) polidocanol的(de)(de)(de)有效期(qi)為(wei)1個月，沒(mei)有明顯的(de)(de)(de)活性(xing)(xing)(xing)(xing)損失。

朗繆爾(er)單(dan)(dan)分(fen)(fen)(fen)子(zi)膜(mo)和(he)表(biao)面壓(ya)(ya)力面積(ji)等溫(wen)線。 純DMPA和(he)DMPA/DSAP混(hun)合單(dan)(dan)分(fen)(fen)(fen)子(zi)膜(mo)的(de)(de)(de)(de)制(zhi)(zhi)備(bei)(bei)方法是將其溶液(ye)（20μL用于1×10-3 mol L-1 DMPA，100μL用于7.3μg/mL DSAP）分(fen)(fen)(fen)散在槽（芬蘭Kibron，體積(ji)為(wei)70 mL，總面積(ji)為(wei)115 cm2）中包含的(de)(de)(de)(de)亞相(xiang)上，并由(you)2 mmol組成 ● 50 mmol中的(de)(de)(de)(de)L-1 MgCl2 ● L-1氨酚緩(huan)沖液(ye)，pH 9.4（DSAP催化活性的(de)(de)(de)(de)最(zui)佳(jia)值），導致初始零(ling)表(biao)面壓(ya)(ya)力。 DMPA溶液(ye)在氯仿/甲(jia)醇混(hun)合物(wu)（3:1）中制(zhi)(zhi)備(bei)(bei)，如(ru)別處所述。40對于脂質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)/蛋白質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)混(hun)合單(dan)(dan)層，DSAP溶液(ye)在5 mmol中制(zhi)(zhi)備(bei)(bei) ● 含有2 mmol的(de)(de)(de)(de)pH值為(wei)7.5的(de)(de)(de)(de)L-1 Tris“HCl緩(huan)沖液(ye) ● DMPA單(dan)(dan)分(fen)(fen)(fen)子(zi)膜(mo)形成后(hou)，在界面擴散L-1MgCl2和(he)0.01%polidocanol（DSAP儲存的(de)(de)(de)(de)最(zui)佳(jia)條(tiao)件），在混(hun)合單(dan)(dan)分(fen)(fen)(fen)子(zi)膜(mo)中提供(gong)6.12 ng/cm2的(de)(de)(de)(de)初始酶表(biao)面密度（以1:3500的(de)(de)(de)(de)摩(mo)爾(er)比例，蛋白質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)/脂質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)）。 大約10-15分(fen)(fen)(fen)鐘用于表(biao)面壓(ya)(ya)力穩定、溶劑蒸發和(he)單(dan)(dan)層組分(fen)(fen)(fen)的(de)(de)(de)(de)橫向擴散。 然后(hou)通過使用側向屏障(zhang)壓(ya)(ya)縮單(dan)(dan)層（純或混(hun)合），直(zhi)至達到塌陷(xian)。 為(wei)了比較(jiao)純脂質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)和(he)混(hun)合蛋白質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)/脂質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)單(dan)(dan)層的(de)(de)(de)(de)曲線，將兩種(zhong)等溫(wen)線記錄為(wei)平均脂質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)分(fen)(fen)(fen)子(zi)面積(ji)的(de)(de)(de)(de)函數。 單(dan)(dan)層實驗在37±1°C下進行(xing)。

為了(le)測試非(fei)離子(zi)表面活性劑的影響，記錄(lu)了(le)在2.5×10-7mol/L聚對苯二(er)甲酸乙二(er)醇酯水溶液(ye)上DMPA單層的等(deng)溫線(xian)。 這實際上與在純(chun)水上得(de)到的DMPA一致。

酶(mei)活性(xing)。 在(zai)形成(cheng)DSAP/DMPA混合(he)單(dan)層(ceng)后(hou)，界面被壓縮，直(zhi)到(dao)達到(dao)所需的(de)(de)表(biao)面壓力。 將濃縮PNPP溶液注入亞相(xiang)(xiang)，以達到(dao)1 mmol的(de)(de)最終濃度(du) ● L-1（酶(mei)飽和條件(jian)）。 在(zai)37°C下，通(tong)過測量反應(ying)產(chan)物對硝(xiao)基苯酚離(li)子（E 410nm，pH9.4）17600 mol“L-1”cm-1的(de)(de)吸光度(du)，在(zai)亞階段監(jian)測底(di)物水(shui)解(jie)。 這些測量是通(tong)過二極管陣(zhen)列分(fen)(fen)光光度(du)計（Spectropete，世界精(jing)密儀(yi)器公司，美國）的(de)(de)采樣微升(sheng)尖端(duan)完成(cheng)的(de)(de)。 該(gai)測量裝置由(you)一個位于微移液管頂端(duan)的(de)(de)特(te)殊微室組成(cheng)，該(gai)微室配有一根發射收集光纖和一個微插入器。 在(zai)整個實驗過程中(zhong)，在(zai)連續攪拌下，微細(xi)胞尖端(duan)直(zhi)接(jie)浸入單(dan)層(ceng)亞相(xiang)(xiang)。 在(zai)適當的(de)(de)時間(jian)間(jian)隔(ge)內，自動(dong)提取(qu)約(yue)2μL亞相(xiang)(xiang)的(de)(de)等份，并通(tong)過計算機記(ji)錄整個吸收光譜進(jin)行(xing)分(fen)(fen)析，然后(hou)將提取(qu)體(ti)積返回(hui)亞相(xiang)(xiang)，保(bao)持槽體(ti)積恒定。

在(zai)(zai)沒有(you)(you)酶或(huo)單(dan)(dan)層(ceng)的(de)(de)情況(kuang)下進(jin)行(xing)對照實驗(yan)，以確保估(gu)計的(de)(de)酶活(huo)性(xing)(xing)完全是由于(yu)界面上(shang)存在(zai)(zai)的(de)(de)酶。簡(jian)而言之(zhi)，實驗(yan)中(zhong)(zhong)使用的(de)(de)槽(cao)有(you)(you)三(san)個隔(ge)間，通過(guo)狹(xia)縫從一(yi)側連接到另一(yi)側（0.5 mm寬(kuan)，2 mm長，0.2 mm深(shen)）在(zai)(zai)接口水平面。因此，有(you)(you)兩個“橫向”隔(ge)室(shi)和(he)(he)一(yi)個“中(zhong)(zhong)央”隔(ge)室(shi)。隔(ge)室(shi)的(de)(de)墻壁防止“通信”在(zai)(zai)亞相(xiang)之(zhi)間，我們可以認(ren)為它們是孤立(li)的(de)(de)。DMPA和(he)(he)酶在(zai)(zai)槽(cao)上(shang)擴散，并在(zai)(zai)一(yi)定時間內（20分鐘）擴散。允許溶(rong)劑蒸(zheng)發和(he)(he)平衡。之(zhi)后，使用兩個橫向屏障壓縮混合(he)單(dan)(dan)層(ceng)，將其(qi)限制在(zai)(zai)中(zhong)(zhong)央隔(ge)室(shi)的(de)(de)界面上(shang)。然(ran)后將底物PNPP注入三(san)個隔(ge)室(shi)的(de)(de)亞相(xiang)，并通過(guo)監測(ce)(ce)ab測(ce)(ce)定所(suo)有(you)(you)隔(ge)室(shi)中(zhong)(zhong)的(de)(de)酶活(huo)性(xing)(xing)PNPP水解產物的(de)(de)吸附性(xing)(xing)。對照實驗(yan)也在(zai)(zai)均相(xiang)介質中(zhong)(zhong)進(jin)行(xing)，使用1mmol●L-1 PNPP和(he)(he)2 mmol●50 mmol中(zhong)(zhong)的(de)(de)L-1 MgCl2●L-1 AMPOL緩沖液，pH值9.4（酶活(huo)性(xing)(xing)評估(gu)和(he)(he)底物飽和(he)(he)的(de)(de)最佳條件）。Langmuir單(dan)(dan)分子膜(mo)的(de)(de)酶活(huo)性(xing)(xing)以溶(rong)液中(zhong)(zhong)測(ce)(ce)定的(de)(de)百(bai)分比表(biao)示(shi)（約1480 nmol PNP-“min-1”mg-1酶）。

在(zai)玉蘭油玉蘭油玉蘭油（Paulo）、巴西(xi)RieBiRa Pro to Pror大學的(de)(de)實驗室(shi)中，用熒(ying)光顯微鏡（OLYBUS B-MAX）獲得了(le)混合(he)單(dan)分子層的(de)(de)熒(ying)光顯微照片。配備高靈敏度(du)SIT攝像機（濱松C-24）.使用透析(xi)共軛技術41用異硫(liu)氰酸熒(ying)光素標記(ji)的(de)(de)DSAP作為熒(ying)光探針。考慮到標記(ji)可使蛋(dan)白質(zhi)(zhi)(zhi)變性，僅1 mol%的(de)(de)標記(ji)蛋(dan)白質(zhi)(zhi)(zhi)與天然DSAP混合(he)，這足以在(zai)空氣/水(shui)界面識別(bie)富含蛋(dan)白質(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)結(jie)構(gou)域(yu)。

分子表面包裝對于磷脂單分子層膜中的錨定蛋白中酶活性的調制作用的影響——摘要、介紹

分子表面包裝對于磷脂單分子層膜中的錨定蛋白中酶活性的調制作用的影響——材料和方法

分子表面包裝對于磷脂單分子層膜中的錨定蛋白中酶活性的調制作用的影響——結果和討論

分子表面包裝對于磷脂單分子層膜中的錨定蛋白中酶活性的調制作用的影響——結論、致謝！