3.結果

3.1.精漿的界面性質

精漿(jiang)SDS-PAGE電泳(yong)顯示存在一系列(lie)不(bu)同(tong)比(bi)例的14至120 kDa的多肽（圖1），與先前(qian)的研(yan)究結果一致[37]。在車道(dao)4上估計(ji)了14至30 kDa之間的五個(ge)主要波(bo)段的比(bi)例。

圖1。從牛射(she)精中分離并以不同濃度沉(chen)積的(de)精漿(jiang)SDS-PAGE凝(ning)膠(jiao)：lane 1:1μg；泳道2:2μg；泳道3:5μg和泳道4:10μg。

在大約(yue)16–17 kDa（74%強度）處(chu)發現(xian)了兩(liang)條(tiao)非常緊(jin)密和強烈(lie)的條(tiao)帶(dai)(dai)。它們被歸因于(yu)(yu)BSP1和BSP3[12]。在大約(yue)28 kDa（9%）處(chu)檢(jian)測(ce)到(dao)第二條(tiao)帶(dai)(dai)，對應于(yu)(yu)BSP5[12]。BSP1、BSP3和BSP5代表精漿中所含最(zui)小多肽的83%（在整(zheng)個提取物中約(yue)占65%）[17]。另一條(tiao)帶(dai)(dai)在22kDa（4%）處(chu)檢(jian)測(ce)到(dao)，另一條(tiao)帶(dai)(dai)在14kDa（13%）處(chu)檢(jian)測(ce)到(dao)，對應于(yu)(yu)核糖核酸酶[22]。

通(tong)過跟(gen)蹤精漿(jiang)水(shui)溶液的(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)面(mian)(mian)(mian)(mian)張(zhang)力(li)(li)(li)(li)（圖2）與濃(nong)度（吉布斯膜(mo)(mo)），突出了(le)這(zhe)些(xie)組分(fen)(fen)的(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)面(mian)(mian)(mian)(mian)活性(xing)(xing)(xing)。新(xin)樣品的(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)面(mian)(mian)(mian)(mian)張(zhang)力(li)(li)(li)(li)相對較低（47 mN/m），并隨著樣品的(de)(de)(de)(de)稀釋而增(zeng)加。在1/100000的(de)(de)(de)(de)大(da)稀釋后(hou)，表(biao)(biao)面(mian)(mian)(mian)(mian)張(zhang)力(li)(li)(li)(li)值等于純(chun)緩沖-空氣(qi)界面(mian)(mian)(mian)(mian)（72 mN/m）的(de)(de)(de)(de)值。因此，精漿(jiang)顯示出顯著的(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)面(mian)(mian)(mian)(mian)活性(xing)(xing)(xing)：首先，新(xin)鮮樣品（47 mN/m）的(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)面(mian)(mian)(mian)(mian)張(zhang)力(li)(li)(li)(li)與已(yi)知(zhi)表(biao)(biao)面(mian)(mian)(mian)(mian)活性(xing)(xing)(xing)蛋白(bai)（如牛血清白(bai)蛋白(bai)[38]或(huo)溶菌酶[39]）的(de)(de)(de)(de)值一樣低，其(qi)次，表(biao)(biao)面(mian)(mian)(mian)(mian)活性(xing)(xing)(xing)仍(reng)然存在于較大(da)的(de)(de)(de)(de)濃(nong)度范圍內（需要稀釋100000以去除表(biao)(biao)面(mian)(mian)(mian)(mian)活性(xing)(xing)(xing)）。此外，通(tong)過朗繆(mou)爾薄膜(mo)(mo)分(fen)(fen)析了(le)空氣(qi)-緩沖界面(mian)(mian)(mian)(mian)處(chu)表(biao)(biao)面(mian)(mian)(mian)(mian)薄膜(mo)(mo)的(de)(de)(de)(de)穩定性(xing)(xing)(xing)。薄膜(mo)(mo)的(de)(de)(de)(de)壓(ya)縮等溫線（圖3）顯示壓(ya)力(li)(li)(li)(li)在兩個步驟中從0顯著增(zeng)加到(dao)35 mN/m。在18.9 mN/m時，出現斜(xie)率斷裂，這(zhe)與空氣(qi)-緩沖界面(mian)(mian)(mian)(mian)分(fen)(fen)子構象的(de)(de)(de)(de)變化有關。在較高壓(ya)力(li)(li)(li)(li)下壓(ya)縮膜(mo)(mo)的(de)(de)(de)(de)能(neng)力(li)(li)(li)(li)（大(da)約(yue)與生物(wu)膜(mo)(mo)相關的(de)(de)(de)(de)壓(ya)力(li)(li)(li)(li)，25 mN/m）表(biao)(biao)明，由精漿(jiang)成(cheng)分(fen)(fen)形成(cheng)的(de)(de)(de)(de)膜(mo)(mo)具(ju)有較高的(de)(de)(de)(de)穩定性(xing)(xing)(xing)。

圖(tu)2。牛精漿溶液在空氣-水界面處的表面張力（±標準偏差），與(yu)提取物中所含(han)蛋白質(zhi)的濃(nong)度(du)有關，并(bing)以對數標度(du)表示（T=23.2℃±0.3℃，n=2，每個樣品重復4次(ci)）。

圖(tu)3。通過(guo)傳播精漿在(zai)空氣(qi)/緩沖液(ye)界面(mian)形成的單層的表面(mian)壓力面(mian)積（π–A）等溫線(xian)（n=3，標準偏差(cha)在(zai)0-18.9 mN/m范圍內(nei)不超過(guo)1.5 mN/m，在(zai)18.9-38 mN/m范圍內(nei)不超過(guo)1.2 mN/m）。

3.2.低密度脂蛋白和(he)脂質體對精子膜仿生(sheng)外(wai)小葉的作用

將低密(mi)(mi)度脂(zhi)(zhi)(zhi)蛋白(bai)和脂(zhi)(zhi)(zhi)質體(ti)(ti)(ti)(ti)引入精子膜仿生外小葉(xie)亞(ya)期的(de)(de)(de)(de)(de)影響如(ru)圖(tu)4所(suo)示。對于控(kong)制測量（未注(zhu)入任何保護劑，設計為圖(tu)4中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)M），表(biao)面(mian)積隨時間略微減小。當低密(mi)(mi)度脂(zhi)(zhi)(zhi)蛋白(bai)被注(zhu)射到重建的(de)(de)(de)(de)(de)外小葉(xie)下方(fang)的(de)(de)(de)(de)(de)亞(ya)相(xiang)(xiang)（圖(tu)4中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)曲(qu)線(xian)M/LDL）時，它導致表(biao)面(mian)積快速而大(da)的(de)(de)(de)(de)(de)增加。相(xiang)(xiang)反(fan)，與參考單層(ceng)(ceng)（曲(qu)線(xian)M）相(xiang)(xiang)比，脂(zhi)(zhi)(zhi)質體(ti)(ti)(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)注(zhu)射（圖(tu)4中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)曲(qu)線(xian)M/C4）幾乎沒(mei)有改變單層(ceng)(ceng)的(de)(de)(de)(de)(de)膜壓力。脂(zhi)(zhi)(zhi)質體(ti)(ti)(ti)(ti)與單層(ceng)(ceng)脂(zhi)(zhi)(zhi)質體(ti)(ti)(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)結合(he)動力學(xue)比低密(mi)(mi)度脂(zhi)(zhi)(zhi)蛋白(bai)慢得多。因此，在(zai)與精液制備相(xiang)(xiang)對應的(de)(de)(de)(de)(de)時間尺度上(shang)，脂(zhi)(zhi)(zhi)質體(ti)(ti)(ti)(ti)在(zai)空氣(qi)-水界面(mian)上(shang)的(de)(de)(de)(de)(de)吸附較弱(ruo)。

圖4。單層（M）所覆蓋的(de)界面(mian)的(de)相(xiang)對表(biao)面(mian)積隨時間的(de)變化(hua)，該(gai)單層（M）以(yi)25 mN/M的(de)速度壓(ya)縮，并在不含(han)(han)任(ren)何額(e)外分子（-）的(de)緩沖(chong)液上形成，（…）LDL（4.6 mg PC）和（-）脂質(zhi)體(ti)C4（含(han)(han)4.8 mg PC）。空氣-緩沖(chong)界面(mian)處(chu)的(de)溫度為34℃。

對(dui)(dui)于低密(mi)度(du)(du)(du)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)，根(gen)據(ju)低密(mi)度(du)(du)(du)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)的(de)(de)(de)(de)組成(cheng)，注射磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酰(xian)膽(dan)堿(jian)的(de)(de)(de)(de)量(liang)估(gu)計(ji)為4.6毫(hao)克(ke)[33]。就脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)體(ti)而(er)(er)言，該分(fen)(fen)散(san)體(ti)含有(you)(you)6.55±0.02 mg脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)，即4.8 mg磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酰(xian)膽(dan)堿(jian)。在(zai)(zai)重建的(de)(de)(de)(de)精子膜外小葉下(xia)注射低密(mi)度(du)(du)(du)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)后(hou)，表面積的(de)(de)(de)(de)大幅(fu)增(zeng)加(jia)可能(neng)(neng)(neng)(neng)與低密(mi)度(du)(du)(du)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)在(zai)(zai)空氣(qi)-水界面自(zi)發吸(xi)附和(he)(he)(he)擴(kuo)散(san)的(de)(de)(de)(de)能(neng)(neng)(neng)(neng)力有(you)(you)關[33]。低密(mi)度(du)(du)(du)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)在(zai)(zai)界面處(chu)的(de)(de)(de)(de)容易破壞可能(neng)(neng)(neng)(neng)釋(shi)放出磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)和(he)(he)(he)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)質(zhi)，這(zhe)些磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)和(he)(he)(he)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)質(zhi)是(shi)表面活(huo)性(xing)(xing)物(wu)質(zhi)，而(er)(er)甘(gan)油三酯是(shi)不(bu)(bu)可溶的(de)(de)(de)(de)[33]。對(dui)(dui)于脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)體(ti)，形成(cheng)雙(shuang)層磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)和(he)(he)(he)形成(cheng)單(dan)(dan)層磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)之(zhi)間(jian)的(de)(de)(de)(de)平衡取決于鏈不(bu)(bu)飽和(he)(he)(he)度(du)(du)(du)、鏈長(chang)和(he)(he)(he)極(ji)性(xing)(xing)頭(tou)基(ji)(ji)[40]。考慮到雞(ji)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)卵磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)（PC 74%）的(de)(de)(de)(de)主(zhu)要成(cheng)分(fen)(fen)及其(qi)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)肪酸組成(cheng)[41]，飽和(he)(he)(he)PC和(he)(he)(he)不(bu)(bu)飽和(he)(he)(he)PC的(de)(de)(de)(de)比例分(fen)(fen)別約為48%和(he)(he)(he)52%。在(zai)(zai)本研(yan)究的(de)(de)(de)(de)溫度(du)(du)(du)下(xia)，飽和(he)(he)(he)PC未熔(rong)化，可能(neng)(neng)(neng)(neng)不(bu)(bu)會在(zai)(zai)界面擴(kuo)散(san)，而(er)(er)不(bu)(bu)飽和(he)(he)(he)PC遠遠超過(guo)其(qi)熔(rong)化溫度(du)(du)(du)，并(bing)可能(neng)(neng)(neng)(neng)擴(kuo)散(san)。在(zai)(zai)剩余的(de)(de)(de)(de)部分(fen)(fen)PE（11%）中(zhong)，形成(cheng)磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)雙(shuang)層和(he)(he)(he)單(dan)(dan)層之(zhi)間(jian)的(de)(de)(de)(de)平衡與磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)結(jie)(jie)構密(mi)切相關，因此不(bu)(bu)能(neng)(neng)(neng)(neng)對(dui)(dui)它(ta)們給出任(ren)何結(jie)(jie)論(lun)。因此，沒有(you)(you)基(ji)(ji)本的(de)(de)(de)(de)解釋(shi)。雞(ji)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)體(ti)缺乏吸(xi)附可以(yi)解釋(shi)為其(qi)擴(kuo)散(san)之(zhi)前已(yi)在(zai)(zai)自(zi)由界面上進行過(guo)檢查：界面上已(yi)經(jing)存在(zai)(zai)的(de)(de)(de)(de)單(dan)(dan)層可能(neng)(neng)(neng)(neng)會限制磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)基(ji)(ji)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)體(ti)的(de)(de)(de)(de)擴(kuo)散(san)，而(er)(er)磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)基(ji)(ji)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)體(ti)在(zai)(zai)其(qi)他地方被認為是(shi)高穩定性(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)散(san)裝(zhuang)物(wu)，尤其(qi)是(shi)由磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酰(xian)膽(dan)堿(jian)組成(cheng)時。

3.3.低密度脂蛋白和脂質體分離精漿成分

將牛精漿(jiang)（SP）注射(she)到單(dan)層下方時(shi)，監測分子(zi)面(mian)(mian)(mian)(mian)積隨時(shi)間(jian)的(de)(de)(de)變化（圖5中的(de)(de)(de)曲線M/SP）。由于脂質覆蓋了界面(mian)(mian)(mian)(mian)，表面(mian)(mian)(mian)(mian)積并沒有立即增(zeng)(zeng)加(jia)，而(er)是(shi)在(zai)150s后(hou)才增(zeng)(zeng)加(jia)。它在(zai)150秒(miao)(miao)(miao)內達到最大(da)值（注射(she)后(hou)300秒(miao)(miao)(miao)），然后(hou)穩定300秒(miao)(miao)(miao)并隨時(shi)間(jian)緩慢(man)下降（圖5）。表面(mian)(mian)(mian)(mian)積的(de)(de)(de)快速增(zeng)(zeng)加(jia)表明SP組分（很可(ke)能是(shi)蛋(dan)白質）具有良好的(de)(de)(de)表面(mian)(mian)(mian)(mian)活(huo)性(xing)，如圖所示(shi)。2和3。600秒(miao)(miao)(miao)后(hou)，比表面(mian)(mian)(mian)(mian)積的(de)(de)(de)減(jian)小速度與純單(dan)分子(zi)膜(mo)相同。因此，BSP蛋(dan)白一旦被吸附，就會留在(zai)界面(mian)(mian)(mian)(mian)上。

圖5。注入（…）后，由單(dan)層（M）覆蓋并(bing)在不含（-）額外分子的(de)緩(huan)沖液上形成的(de)界面(mian)的(de)相對表面(mian)積隨時間的(de)變化SP（26.6±1.5 mg蛋白質(zhi)）、SP（26.6±1.5 mg蛋白質(zhi)）和(he)不同濃度(du)（··-）C1、（·-）C2的(de)脂質(zhi)體的(de)混合物(wu)，（·-）C3和(he)（·-）C4（分別為1.17±0.02 mg、2.18±0.02 mg、4.37±0.02 mg和(he)6.55±0.02 mg脂質(zhi)）和(he)（－－－）LDL（4.6 mg PC）和(he)SP（26.6±1.5 mg蛋白質(zhi)）的(de)混合物(wu)。空氣(qi)-緩(huan)沖界面(mian)處的(de)溫度(du)為34℃。表面(mian)壓力保持在25 mN/m。

當LDL與牛精漿以重量-蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)比(bi)10:1（BSP:LDL）混合并(bing)注射(she)(she)到單層(ceng)下(xia)方時，隨時間記錄的(de)(de)(de)(de)單層(ceng)分(fen)子(zi)(zi)面積(ji)幾乎沒(mei)有變(bian)化(hua)（曲(qu)線(xian)M/SP+LDL，圖5）。400秒(miao)左右出現(xian)一(yi)個肩(jian)部，顯(xian)示BSP蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)的(de)(de)(de)(de)弱吸(xi)附(fu)（該(gai)肩(jian)部代表M/SP的(de)(de)(de)(de)5%，上圖曲(qu)線(xian)）。然后，分(fen)子(zi)(zi)面積(ji)的(de)(de)(de)(de)變(bian)化(hua)在1000秒(miao)后減小并(bing)趨(qu)于穩定。其下(xia)降幅度不如M和(he)M/SP曲(qu)線(xian)的(de)(de)(de)(de)變(bian)化(hua)幅度大，表明LDL組(zu)分(fen)吸(xi)附(fu)，與它(ta)們在界(jie)(jie)面上的(de)(de)(de)(de)高擴散能力一(yi)致（曲(qu)線(xian)M/LDL，圖4）。因(yin)此，由于低密度脂(zhi)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)（LDL），SP中BSP蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)在界(jie)(jie)面上的(de)(de)(de)(de)吸(xi)附(fu)大大減少，BSP/LDL的(de)(de)(de)(de)比(bi)率非常接(jie)近最(zui)佳值(zhi)，以完全(quan)防止BSP蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)影響單層(ceng)。根(gen)據低密度脂(zhi)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)的(de)(de)(de)(de)組(zu)成，注射(she)(she)磷(lin)脂(zhi)酰(xian)(xian)膽(dan)堿的(de)(de)(de)(de)量估(gu)計(ji)為4.61毫克[33]。因(yin)此，向4.61 mg低密度脂(zhi)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)磷(lin)脂(zhi)酰(xian)(xian)膽(dan)堿注射(she)(she)26.6 mg精漿蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)，即0.17 mg磷(lin)脂(zhi)酰(xian)(xian)膽(dan)堿注射(she)(she)1 mg精漿蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)。

脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體（不同濃度）對BSP蛋白(bai)(bai)(bai)的作(zuo)用(yong)也如圖(tu)5所示。脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體在進入亞(ya)階(jie)段(duan)前(qian)與精漿接觸。隨著(zhu)脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體中濃度的增(zeng)加(jia)（曲線(xian)(xian)M/SP+C1至C4），BSP蛋白(bai)(bai)(bai)吸附引起的表(biao)面積增(zeng)加(jia)逐漸延遲并減少(shao)。當含量達到4.37 mg（C3）時(shi)，界(jie)面上仍有少(shao)量BSP蛋白(bai)(bai)(bai)摻入，1600 s時(shi)出現肩部。在最(zui)高濃度（C4）下，未(wei)觀察到BSP蛋白(bai)(bai)(bai)摻入，分(fen)子面積的變化(hua)甚(shen)至比(bi)對照曲線(xian)(xian)更負(fu)，表(biao)明膜組分(fen)在亞(ya)相(xiang)中輕微溶(rong)解。因此，脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體作(zuo)用(yong)于BSP蛋白(bai)(bai)(bai)的方式(shi)與LDL相(xiang)同。最(zui)有趣的比(bi)例似乎介于C3和(he)C4之(zhi)間。根據確(que)定面積變化(hua)與脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體注射磷脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)量之(zhi)間相(xiang)互作(zuo)用(yong)的曲線(xian)(xian)計算得出（圖(tu)6）。注射26.6 mg BSP的最(zui)佳(jia)質(zhi)(zhi)(zhi)量為4.6 mg，即PC:BSP比(bi)為0.16（w/w）。

圖6。相對面積隨注射到(dao)亞相的脂質體質量的變(bian)化。線(xian)性回歸(gui)的R2為0.992。

3.4.脂質體對精漿作用的顯微評價

用透(tou)(tou)射電(dian)鏡（TEM）觀察(cha)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)(ti)或(huo)LDL與(yu)含有(you)SP的(de)(de)(de)BSP蛋白(bai)的(de)(de)(de)混合(he)物(wu)，并與(yu)對(dui)照組進行比(bi)(bi)較(jiao)。無論放大(da)(da)倍(bei)數如何，與(yu)精漿相對(dui)應(ying)的(de)(de)(de)圖(tu)像均未顯(xian)示(shi)任何結(jie)構(gou)(gou)（圖(tu)S1）。相反，與(yu)LDL和(he)(he)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)(ti)相關的(de)(de)(de)結(jie)構(gou)(gou)很容易(yi)通過（i）LDL的(de)(de)(de)致密且相當圓的(de)(de)(de)形狀（圖(tu)7A）和(he)(he)（ii）脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)(ti)的(de)(de)(de)圓形且有(you)時(shi)為多層(ceng)結(jie)構(gou)(gou)（圖(tu)7B）來識別。在(zai)存(cun)在(zai)精漿的(de)(de)(de)情(qing)況下，對(dui)整套圖(tu)像的(de)(de)(de)分(fen)析仍然顯(xian)示(shi)出圓形物(wu)體(ti)(ti)。它們的(de)(de)(de)大(da)(da)小平均與(yu)未使用螯合(he)劑(ji)分(fen)析的(de)(de)(de)大(da)(da)小相似（圖(tu)S2）。然而，在(zai)SP存(cun)在(zai)的(de)(de)(de)幾個地方(fang)，觀察(cha)到(dao)一些(xie)大(da)(da)的(de)(de)(de)圓形物(wu)體(ti)(ti)，其特征是（i）被厚層(ceng)（圖(tu)7C含LDL）包(bao)圍的(de)(de)(de)天然狀結(jie)構(gou)(gou)，或(huo)（ii）環形內的(de)(de)(de)致密核心(xin)（圖(tu)7D含脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)(ti)和(he)(he)圖(tu)S3）。與(yu)圖(tu)7B相比(bi)(bi)，與(yu)精漿混合(he)的(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)(ti)系統地呈現出比(bi)(bi)天然脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)(ti)更致密的(de)(de)(de)核心(xin)。這些(xie)新結(jie)構(gou)(gou)可(ke)能是由(you)于BSP蛋白(bai)滲透(tou)(tou)到(dao)界面層(ceng)而導致膜破裂的(de)(de)(de)結(jie)果，從而導致TEM對(dui)比(bi)(bi)度的(de)(de)(de)改變。

圖(tu)7。（A）低密度脂(zhi)蛋(dan)(dan)白(bai)，（B）脂(zhi)質(zhi)體(ti)，（C）低密度脂(zhi)蛋(dan)(dan)白(bai)和精(jing)漿(jiang)(jiang)（精(jing)漿(jiang)(jiang)中的比例為0.17 mg PC/mg BSP蛋(dan)(dan)白(bai)質(zhi)）和（D）脂(zhi)質(zhi)體(ti)和精(jing)漿(jiang)(jiang)（精(jing)漿(jiang)(jiang)中的比例為0.16 mg PC脂(zhi)質(zhi)體(ti)/mg BSP蛋(dan)(dan)白(bai)質(zhi)）的冷凍電鏡(jing)圖(tu)像。

4.討論

4.1.BSP蛋白的表面性質及其可能的生物學作用

張力測定結果顯示精漿(jiang)中(zhong)含有表面(mian)活性(xing)(xing)成分。這(zhe)些很(hen)(hen)可(ke)能是蛋白質，因(yin)為(wei)它(ta)們(men)(men)(men)(men)構(gou)成精漿(jiang)的(de)(de)(de)(de)主要(yao)部分。它(ta)們(men)(men)(men)(men)由(you)(you)幾個(ge)親水(shui)性(xing)(xing)和疏(shu)水(shui)性(xing)(xing)域(yu)組成[5]，賦(fu)予它(ta)們(men)(men)(men)(men)兩親性(xing)(xing)。考(kao)慮到(dao)生物學(xue)背景(jing)，我(wo)們(men)(men)(men)(men)可(ke)以(yi)(yi)假設(she)BSP蛋白能夠到(dao)達磷(lin)(lin)脂覆蓋(gai)的(de)(de)(de)(de)界面(mian)，這(zhe)是由(you)(you)于(yu)它(ta)們(men)(men)(men)(men)與PC的(de)(de)(de)(de)相(xiang)互(hu)作(zuo)(zuo)用(yong)和自(zi)身(shen)的(de)(de)(de)(de)表面(mian)活性(xing)(xing)。這(zhe)可(ke)以(yi)(yi)解釋為(wei)什(shen)么這(zhe)個(ge)過(guo)程很(hen)(hen)快[42]。將肽或蛋白質插(cha)入磷(lin)(lin)脂單分子(zi)膜(mo)通常在(zai)比(bi)凝聚域(yu)更可(ke)壓縮的(de)(de)(de)(de)流(liu)(liu)體域(yu)中(zhong)進行[43]。在(zai)34°C時，液域(yu)由(you)(you)血(xue)漿(jiang)鹵素和不(bu)飽(bao)和磷(lin)(lin)脂酰膽堿(jian)組成[35]。因(yin)此，根(gen)據前面(mian)提(ti)到(dao)的(de)(de)(de)(de)涉及疏(shu)水(shui)腔的(de)(de)(de)(de)機制，BSP蛋白可(ke)以(yi)(yi)很(hen)(hen)容(rong)易地穿透這(zhe)些流(liu)(liu)體結構(gou)域(yu)，在(zai)這(zhe)些流(liu)(liu)體結構(gou)域(yu)中(zhong)它(ta)們(men)(men)(men)(men)可(ke)以(yi)(yi)立即(ji)與含有磷(lin)(lin)酸膽堿(jian)的(de)(de)(de)(de)分子(zi)相(xiang)互(hu)作(zuo)(zuo)用(yong)[11,12,34,42,44–46]。吸附的(de)(de)(de)(de)BSP量可(ke)能受到(dao)流(liu)(liu)體域(yu)可(ke)壓縮性(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)限制。綜(zong)上所(suo)述，BSP蛋白質一旦被吸附，由(you)(you)于(yu)其(qi)表面(mian)性(xing)(xing)質（我(wo)們(men)(men)(men)(men)的(de)(de)(de)(de)工作(zuo)(zuo)）、構(gou)象重(zhong)排[47]以(yi)(yi)及它(ta)們(men)(men)(men)(men)與膜(mo)組件的(de)(de)(de)(de)強烈相(xiang)互(hu)作(zuo)(zuo)用(yong)[48]，仍然固定在(zai)界面(mian)上。

4.2.脂質體和低密度脂蛋白在分離BSP蛋白中的作用

我們的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)結果表(biao)明，只(zhi)要使用(yong)合(he)適的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)(ti)/BSP比(bi)(bi)例，脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)(ti)就可(ke)(ke)(ke)以(yi)像(xiang)LDL一樣(yang)(yang)有(you)效地阻止(zhi)BSP蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)到達(da)界面(mian)(mian)。對于低密(mi)度脂(zhi)(zhi)(zhi)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)，我們的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)模型顯示，低溫保存(cun)中(zhong)常用(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)BSP/LDL比(bi)(bi)率(lv)（10:1 w/w）非(fei)常接近(jin)最(zui)佳值，以(yi)完全防止(zhi)BSP蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)影響(xiang)單(dan)層。低密(mi)度脂(zhi)(zhi)(zhi)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)組織(zhi)中(zhong)PC/BSP與(yu)(yu)PC的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)比(bi)(bi)率(lv)為0.17 mg磷脂(zhi)(zhi)(zhi)酰膽堿(jian)，1 mg精(jing)(jing)漿蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)。同(tong)(tong)樣(yang)(yang)，脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)最(zui)佳比(bi)(bi)例PC/BSP為0.16 mg磷脂(zhi)(zhi)(zhi)酰膽堿(jian)和1 mg精(jing)(jing)漿蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)。知道卵子中(zhong)PC的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)比(bi)(bi)例可(ke)(ke)(ke)能取決于喂食情況(kuang)，不同(tong)(tong)批次的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)LDL中(zhong)PC的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)比(bi)(bi)例可(ke)(ke)(ke)能不同(tong)(tong)，因此這(zhe)些(xie)(xie)比(bi)(bi)例被(bei)(bei)認為是相(xiang)等(deng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)。該(gai)比(bi)(bi)率(lv)與(yu)(yu)LDL或(huo)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)隔離結構(gou)無關的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)事實表(biao)明，LDL中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)載脂(zhi)(zhi)(zhi)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)不與(yu)(yu)BSP結合(he)，盡管這(zhe)種結合(he)是可(ke)(ke)(ke)能的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)[26,49]。更引人注目(mu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)是，這(zhe)一結果表(biao)明PC作為LDL中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)單(dan)層或(huo)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)(ti)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)雙(shuang)層組裝沒有(you)影響(xiang)。在(zai)低密(mi)度脂(zhi)(zhi)(zhi)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)情況(kuang)下，磷脂(zhi)(zhi)(zhi)占據外層單(dan)層，并(bing)且(qie)所(suo)有(you)這(zhe)些(xie)(xie)磷脂(zhi)(zhi)(zhi)都可(ke)(ke)(ke)被(bei)(bei)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)接近(jin)。相(xiang)反，只(zhi)有(you)形(xing)成(cheng)單(dan)層脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)雙(shuang)層外小葉(xie)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)磷脂(zhi)(zhi)(zhi)真正與(yu)(yu)BSP蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)直接接觸。由于脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)(ti)和低密(mi)度脂(zhi)(zhi)(zhi)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)絡合(he)比(bi)(bi)率(lv)相(xiang)同(tong)(tong)，并(bing)且(qie)PCP分子（74%）也構(gou)成(cheng)雙(shuang)層的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)內(nei)小葉(xie)，因此這(zhe)些(xie)(xie)分子也參與(yu)(yu)BSP蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)絡合(he)。與(yu)(yu)BSP蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)易于插(cha)入(ru)疏水膜相(xiang)一致(zhi)，這(zhe)些(xie)(xie)BSP蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)可(ke)(ke)(ke)向內(nei)小葉(xie)遷移，并(bing)誘導脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)(ti)雙(shuang)層破(po)裂/融(rong)合(he)，如TEM所(suo)觀察到的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)。然而，樣(yang)(yang)品中(zhong)LDL和脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)結構(gou)變化(hua)并(bing)不普遍，BSP蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)可(ke)(ke)(ke)以(yi)認為主要錨定在(zai)LDL和脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)面(mian)(mian)。當脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)(ti)與(yu)(yu)BSP的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)比(bi)(bi)例高(gao)于本(ben)文所(suo)研究的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)比(bi)(bi)例時，BSP1（BSP家族中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)主要蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)）誘導脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)小泡的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)伸長(chang)和珠項鏈狀(zhuang)結構(gou)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)形(xing)成(cheng)，這(zhe)些(xie)(xie)結構(gou)演(yan)變為小泡或(huo)線(xian)狀(zhuang)結構(gou)[50]。