3、結果

3.1.精漿的界面性質

精(jing)漿(jiang)SDS-PAGE電泳顯示存(cun)在(zai)一系列不同比例的14至(zhi)120 kDa的多肽（圖1），與先(xian)前的研(yan)究(jiu)結果一致[37]。在(zai)車道4上估計了14至(zhi)30 kDa之間的五個主要波(bo)段的比例。

圖(tu)1。從牛(niu)射精中(zhong)分(fen)離(li)并以不同濃度沉積的精漿SDS-PAGE凝膠：lane 1:1g；車道2:2g；車道3:5g和車道4:10g。

在(zai)大(da)約16–17 kDa（74%強度）處(chu)發現了兩條(tiao)(tiao)非常緊密和(he)強烈的條(tiao)(tiao)帶(dai)(dai)。它們被歸(gui)因于BSP1和(he)BSP3[12]。在(zai)大(da)約28 kDa（9%）處(chu)檢(jian)測到第二條(tiao)(tiao)帶(dai)(dai)，對(dui)(dui)應于BSP5[12]。BSP1、BSP3和(he)BSP5代表精(jing)漿(jiang)中(zhong)所含(han)最小多肽的83%（在(zai)整個提取物中(zhong)約占65%）[17]。另一條(tiao)(tiao)帶(dai)(dai)在(zai)22kDa（4%）處(chu)檢(jian)測到，另一條(tiao)(tiao)帶(dai)(dai)在(zai)14kDa（13%）處(chu)檢(jian)測到，對(dui)(dui)應于核糖核酸酶[22]。

圖(tu)2。牛精漿溶液在空氣-水界(jie)面的(de)(de)表(biao)面張力(li)（±標(biao)準(zhun)偏差），與提取物(wu)中(zhong)所含蛋白質的(de)(de)濃度(du)有(you)關(guan)，并以(yi)對數標(biao)度(du)表(biao)示(shi)（T=23.2?C±0.3?C、n=2，每(mei)個樣品重復4次）。

通(tong)過跟蹤(zong)精(jing)漿水溶液（圖(tu)2）的(de)(de)表(biao)面(mian)(mian)(mian)張力與(yu)濃度（吉布斯(si)膜(mo)(mo)）的(de)(de)關(guan)系，突出了(le)組分。新樣品(pin)的(de)(de)表(biao)面(mian)(mian)(mian)張力相(xiang)對較低（47 mN/m），并隨著樣品(pin)的(de)(de)稀釋而增加。在(zai)(zai)1/100000的(de)(de)大稀釋后，表(biao)面(mian)(mian)(mian)張力值等(deng)(deng)于純緩(huan)沖-空氣(qi)界(jie)面(mian)(mian)(mian)（72 mN/m）的(de)(de)值。因此，精(jing)漿顯(xian)示出顯(xian)著的(de)(de)表(biao)面(mian)(mian)(mian)活(huo)性(xing)(xing)：首先，新鮮(xian)樣品(pin)（47 mN/m）的(de)(de)表(biao)面(mian)(mian)(mian)張力與(yu)已知表(biao)面(mian)(mian)(mian)活(huo)性(xing)(xing)蛋(dan)白（如牛血清(qing)白蛋(dan)白[38]或溶菌酶[39]）的(de)(de)值一樣低，其次，表(biao)面(mian)(mian)(mian)活(huo)性(xing)(xing)仍然存(cun)在(zai)(zai)于較大的(de)(de)濃度范圍內（需要稀釋100000以去除表(biao)面(mian)(mian)(mian)活(huo)性(xing)(xing)）。此外，通(tong)過朗繆爾薄(bo)(bo)膜(mo)(mo)分析了(le)空氣(qi)-緩(huan)沖界(jie)面(mian)(mian)(mian)處表(biao)面(mian)(mian)(mian)薄(bo)(bo)膜(mo)(mo)的(de)(de)穩定性(xing)(xing)。薄(bo)(bo)膜(mo)(mo)（）的(de)(de)壓縮等(deng)(deng)溫線顯(xian)示壓力在(zai)(zai)兩(liang)個步驟中從0顯(xian)著增加到(dao)35 mN/m。在(zai)(zai)18.9 mN/m時(shi)，出現斜率(lv)斷(duan)裂(lie)，這(zhe)與(yu)空氣(qi)-緩(huan)沖界(jie)面(mian)(mian)(mian)分子(zi)構(gou)象的(de)(de)變化有(you)關(guan)。在(zai)(zai)較高壓力下壓縮膜(mo)(mo)的(de)(de)能力（大約(yue)與(yu)生物膜(mo)(mo)相(xiang)關(guan)的(de)(de)壓力，25 mN/m）表(biao)明，由精(jing)漿成分形(xing)成的(de)(de)膜(mo)(mo)具有(you)較高的(de)(de)穩定性(xing)(xing)。

通(tong)過傳播精漿(jiang)在空氣/緩沖液界面形成(cheng)的單層的表面壓力面積（?–A）等溫線（n=3，標準偏差(cha)在0-18.9 mN/m范圍(wei)內不超過1.5 mN/m，在18.9-38 mN/m范圍(wei)內不超過1.2 mN/m）。

3.2.低密度脂蛋白和脂質體對精子膜仿生外小葉的作用

將低(di)密度脂(zhi)(zhi)蛋(dan)白和脂(zhi)(zhi)質體(ti)引入(ru)精子膜(mo)仿生外(wai)小(xiao)葉(xie)(xie)亞期(qi)的(de)(de)影響如圖4所示。對于控制(zhi)測量（未注(zhu)入(ru)任(ren)何保護(hu)劑，設計為圖4中的(de)(de)M），表面(mian)積隨時(shi)間(jian)略微減小(xiao)。當低(di)密度脂(zhi)(zhi)蛋(dan)白被注(zhu)射(she)到重建的(de)(de)外(wai)小(xiao)葉(xie)(xie)下(xia)方的(de)(de)亞相（圖4中的(de)(de)曲線(xian)M/LDL）時(shi)，它導致表面(mian)積快速而大的(de)(de)增加。相反，與參考單層(ceng)(ceng)（曲線(xian)M）相比，脂(zhi)(zhi)質體(ti)的(de)(de)注(zhu)射(she)（圖4中的(de)(de)曲線(xian)M/C4）幾乎(hu)沒有改變單層(ceng)(ceng)的(de)(de)膜(mo)壓力(li)(li)。脂(zhi)(zhi)質體(ti)與單層(ceng)(ceng)脂(zhi)(zhi)質體(ti)的(de)(de)結合動力(li)(li)學(xue)比低(di)密度脂(zhi)(zhi)蛋(dan)白慢(man)得多(duo)。因此，在與精液制(zhi)備相對應(ying)的(de)(de)時(shi)間(jian)尺度上(shang)，脂(zhi)(zhi)質體(ti)在空(kong)氣-水界(jie)面(mian)上(shang)的(de)(de)吸附較弱。

圖4。單層(ceng)（M）所(suo)覆(fu)蓋的(de)界面的(de)相對表(biao)面積隨時(shi)間的(de)變化，該(gai)單層(ceng)（M）以25 mN/M的(de)速度壓縮，并(bing)在不含任何(he)額(e)外分子（-）的(de)緩(huan)沖(chong)液上形(xing)成，（…）LDL（4.6 mg PC）和（-）脂質體C4（含4.8 mg PC）。氣(qi)溫是34度?C在空氣(qi)-緩(huan)沖(chong)器接(jie)口處。

對于低(di)密(mi)度(du)(du)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)蛋(dan)白(bai)，根據(ju)低(di)密(mi)度(du)(du)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)蛋(dan)白(bai)的(de)(de)(de)(de)(de)組(zu)成(cheng)，注(zhu)射磷(lin)(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酰膽堿的(de)(de)(de)(de)(de)量估(gu)計為(wei)(wei)4.6毫克[33]。就脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體而言，該分(fen)散體含有(you)6.55±0.02 mg脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)，即4.8 mg磷(lin)(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酰膽堿。在(zai)重建的(de)(de)(de)(de)(de)精(jing)子(zi)膜外小葉下注(zhu)射低(di)密(mi)度(du)(du)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)蛋(dan)白(bai)后，表面(mian)積的(de)(de)(de)(de)(de)大幅(fu)增加可能與低(di)密(mi)度(du)(du)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)蛋(dan)白(bai)在(zai)空氣-水界(jie)面(mian)自(zi)(zi)發(fa)吸附和(he)(he)(he)擴(kuo)散的(de)(de)(de)(de)(de)能力有(you)關(guan)[33]。低(di)密(mi)度(du)(du)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)蛋(dan)白(bai)在(zai)界(jie)面(mian)處(chu)的(de)(de)(de)(de)(de)容易破壞可能釋放出磷(lin)(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)和(he)(he)(he)蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)，這(zhe)些磷(lin)(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)和(he)(he)(he)蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)是(shi)表面(mian)活性物質(zhi)(zhi)(zhi)，而甘油三(san)酯是(shi)不(bu)(bu)可溶的(de)(de)(de)(de)(de)[33]。對于脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體，形成(cheng)雙層磷(lin)(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)和(he)(he)(he)形成(cheng)單層磷(lin)(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)之間的(de)(de)(de)(de)(de)平衡取決于鏈不(bu)(bu)飽(bao)(bao)(bao)和(he)(he)(he)度(du)(du)、鏈長和(he)(he)(he)極性頭基[40]。考慮到雞蛋(dan)卵磷(lin)(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)（PC 74%）的(de)(de)(de)(de)(de)主要成(cheng)分(fen)及其脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)肪酸組(zu)成(cheng)[41]，飽(bao)(bao)(bao)和(he)(he)(he)PC和(he)(he)(he)不(bu)(bu)飽(bao)(bao)(bao)和(he)(he)(he)PC的(de)(de)(de)(de)(de)比(bi)例分(fen)別約(yue)為(wei)(wei)48%和(he)(he)(he)52%。在(zai)本研究的(de)(de)(de)(de)(de)溫度(du)(du)下，飽(bao)(bao)(bao)和(he)(he)(he)PC未熔化，可能不(bu)(bu)會在(zai)界(jie)面(mian)擴(kuo)散，而不(bu)(bu)飽(bao)(bao)(bao)和(he)(he)(he)PC遠(yuan)遠(yuan)超過(guo)其熔化溫度(du)(du)，并可能擴(kuo)散。在(zai)剩余的(de)(de)(de)(de)(de)部分(fen)PE（11%）中，形成(cheng)磷(lin)(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)雙層和(he)(he)(he)單層之間的(de)(de)(de)(de)(de)平衡與磷(lin)(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)結構密(mi)切相(xiang)關(guan)，因此不(bu)(bu)能對它們給出任何結論。因此，沒有(you)基本的(de)(de)(de)(de)(de)解釋。雞蛋(dan)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體缺乏吸附可以解釋為(wei)(wei)其擴(kuo)散之前已在(zai)自(zi)(zi)由界(jie)面(mian)上(shang)進(jin)行過(guo)檢查：界(jie)面(mian)上(shang)已經存在(zai)的(de)(de)(de)(de)(de)單層可能會限(xian)制磷(lin)(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)基脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體的(de)(de)(de)(de)(de)擴(kuo)散，而磷(lin)(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)基脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體在(zai)其他(ta)地(di)方被認(ren)為(wei)(wei)是(shi)高穩定性的(de)(de)(de)(de)(de)散裝物，尤其是(shi)由磷(lin)(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酰膽堿組(zu)成(cheng)時(shi)。

3.3.低密度脂蛋白和脂質體分離精漿成分

將牛精漿（SP）注(zhu)射(she)到單(dan)(dan)層下(xia)方時，監測(ce)分子(zi)面(mian)(mian)(mian)積(ji)隨時間的(de)變化（圖5中的(de)曲線M/SP）。由于脂質覆蓋了界面(mian)(mian)(mian)，表(biao)面(mian)(mian)(mian)積(ji)并沒有立即增(zeng)加(jia)，而(er)是在(zai)(zai)150s后才增(zeng)加(jia)。它(ta)在(zai)(zai)150秒(miao)(miao)內達到最大值（注(zhu)射(she)后300秒(miao)(miao)），然后穩定(ding)300秒(miao)(miao)并隨時間緩慢下(xia)降（圖5）。表(biao)面(mian)(mian)(mian)積(ji)的(de)快速(su)增(zeng)加(jia)表(biao)明SP組分（很可能是蛋白質）具有良好的(de)表(biao)面(mian)(mian)(mian)活性，如圖所示。2和3。600秒(miao)(miao)后，比表(biao)面(mian)(mian)(mian)積(ji)的(de)減小速(su)度與純單(dan)(dan)分子(zi)膜相同。因此(ci)，BSP蛋白一旦被吸附(fu)，就會留在(zai)(zai)界面(mian)(mian)(mian)上。

圖(tu)5。注入（…）后，由單層（M）覆蓋并在不含（-）額外分(fen)子的(de)(de)緩沖液上形(xing)成的(de)(de)界面的(de)(de)相對表(biao)面積隨(sui)時間的(de)(de)變化SP（26.6±1.5 mg蛋(dan)白質(zhi)(zhi)）、SP（26.6±1.5 mg蛋(dan)白質(zhi)(zhi)）和不同濃度(du)（··-）C1、（·-）C2的(de)(de)脂質(zhi)(zhi)體的(de)(de)混合(he)(he)物，（·-）C3和（·-）C4（分(fen)別(bie)為1.17±0.02 mg、2.18±0.02 mg、4.37±0.02 mg和6.55±0.02 mg脂質(zhi)(zhi)）和（－－－）LDL（4.6 mg PC）和SP（26.6±1.5 mg蛋(dan)白質(zhi)(zhi)）的(de)(de)混合(he)(he)物。氣(qi)溫(wen)是34度(du)?C在空氣(qi)-緩沖器接口處。表(biao)面壓力保持在25 mN/m。

當(dang)LDL與牛精漿以(yi)重量-蛋(dan)白(bai)質比(bi)10:1（BSP:LDL）混合并注(zhu)射(she)到單層下方時，隨(sui)時間記錄的(de)單層分子(zi)(zi)面(mian)積幾乎沒有變(bian)(bian)化(hua)（曲(qu)線M/SP+LDL，圖(tu)(tu)5）。400秒左右(you)出現一個肩部(bu)，顯示BSP蛋(dan)白(bai)的(de)弱(ruo)吸(xi)附（該肩部(bu)代(dai)表(biao)(biao)M/SP的(de)5%，上(shang)(shang)圖(tu)(tu)曲(qu)線）。然后(hou)，分子(zi)(zi)面(mian)積的(de)變(bian)(bian)化(hua)在1000秒后(hou)減小(xiao)并趨于(yu)穩定。其下降幅(fu)度不如M和M/SP曲(qu)線的(de)變(bian)(bian)化(hua)幅(fu)度大(da)，表(biao)(biao)明LDL組分吸(xi)附，與它們在界面(mian)上(shang)(shang)的(de)高擴散能力一致（曲(qu)線M/LDL，圖(tu)(tu)4）。因此(ci)，由于(yu)低密(mi)度脂(zhi)(zhi)蛋(dan)白(bai)（LDL），SP中BSP蛋(dan)白(bai)在界面(mian)上(shang)(shang)的(de)吸(xi)附大(da)大(da)減少，BSP/LDL的(de)比(bi)率非常(chang)接近最佳值，以(yi)完全防止BSP蛋(dan)白(bai)影響單層。根(gen)據低密(mi)度脂(zhi)(zhi)蛋(dan)白(bai)的(de)組成，注(zhu)射(she)磷脂(zhi)(zhi)酰膽堿的(de)量估計為4.61毫克[33]。因此(ci)，向4.61 mg低密(mi)度脂(zhi)(zhi)蛋(dan)白(bai)磷脂(zhi)(zhi)酰膽堿注(zhu)射(she)26.6 mg精漿蛋(dan)白(bai)質，即0.17 mg磷脂(zhi)(zhi)酰膽堿注(zhu)射(she)1 mg精漿蛋(dan)白(bai)質。

脂質(zhi)(zhi)體(ti)(ti)（不同濃度）對BSP蛋白(bai)(bai)的(de)作用也如(ru)圖5所示。脂質(zhi)(zhi)體(ti)(ti)在進入亞階段前與(yu)精(jing)漿接觸(chu)。隨著脂質(zhi)(zhi)體(ti)(ti)中(zhong)濃度的(de)增加（曲線M/SP+C1至C4），BSP蛋白(bai)(bai)吸附引起的(de)表(biao)面(mian)積(ji)(ji)增加逐漸延遲并減少。當含量(liang)(liang)達到4.37 mg（C3）時，界面(mian)上(shang)仍有少量(liang)(liang)BSP蛋白(bai)(bai)摻(chan)入，1600 s時出(chu)現(xian)肩部。在最(zui)高(gao)濃度（C4）下，未觀察(cha)到BSP蛋白(bai)(bai)摻(chan)入，分(fen)子(zi)面(mian)積(ji)(ji)的(de)變化甚至比(bi)(bi)對照曲線更(geng)負，表(biao)明膜(mo)組分(fen)在亞相中(zhong)輕微溶解。因此(ci)，脂質(zhi)(zhi)體(ti)(ti)作用于(yu)BSP蛋白(bai)(bai)的(de)方式(shi)與(yu)LDL相同。最(zui)有趣的(de)比(bi)(bi)例(li)似乎(hu)介于(yu)C3和C4之間(jian)。根(gen)據確定面(mian)積(ji)(ji)變化與(yu)脂質(zhi)(zhi)體(ti)(ti)注(zhu)射磷脂質(zhi)(zhi)量(liang)(liang)之間(jian)相互(hu)作用的(de)曲線計(ji)算得出(chu)（圖6）。注(zhu)射26.6 mg BSP的(de)最(zui)佳質(zhi)(zhi)量(liang)(liang)為4.6 mg，即(ji)PC:BSP比(bi)(bi)為0.16（w/w）。

圖6。相(xiang)對(dui)面積隨注射到亞相(xiang)的脂質(zhi)體質(zhi)量的變化。線性回歸的R2為0.992。

3.4.脂質體對精漿作用的顯微評價

用透(tou)射電鏡（TEM）觀(guan)察脂(zhi)(zhi)質(zhi)體(ti)(ti)或LDL與(yu)(yu)(yu)含(han)有(you)(you)SP的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)BSP蛋白的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)混合物(wu)，并與(yu)(yu)(yu)對(dui)照組進行比較(jiao)。無(wu)論放大(da)倍數(shu)如何(he)，與(yu)(yu)(yu)精漿相(xiang)對(dui)應的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)圖(tu)(tu)像均未顯示(shi)任何(he)結(jie)(jie)構(gou)(gou)（圖(tu)(tu)S1）。相(xiang)反，與(yu)(yu)(yu)LDL和脂(zhi)(zhi)質(zhi)體(ti)(ti)相(xiang)關的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)結(jie)(jie)構(gou)(gou)很容易通過（i）LDL的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)致(zhi)密且(qie)相(xiang)當圓(yuan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)形(xing)狀（圖(tu)(tu)7A）和（ii）脂(zhi)(zhi)質(zhi)體(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)圓(yuan)形(xing)且(qie)有(you)(you)時為多層結(jie)(jie)構(gou)(gou)（圖(tu)(tu)7B）來識(shi)別。在(zai)存(cun)在(zai)精漿的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)情況下，對(dui)整套(tao)圖(tu)(tu)像的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分析仍然(ran)顯示(shi)出圓(yuan)形(xing)物(wu)體(ti)(ti)。它們的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)大(da)小平均與(yu)(yu)(yu)未使用螯合劑分析的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)大(da)小相(xiang)似（圖(tu)(tu)S2）。然(ran)而，在(zai)SP存(cun)在(zai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)幾個地(di)方，觀(guan)察到一些大(da)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)圓(yuan)形(xing)物(wu)體(ti)(ti)，其特(te)征是（i）被厚層（圖(tu)(tu)7C含(han)LDL）包圍的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)天(tian)然(ran)狀結(jie)(jie)構(gou)(gou)，或（ii）環形(xing)內的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)致(zhi)密核心（圖(tu)(tu)7D含(han)脂(zhi)(zhi)質(zhi)體(ti)(ti)和圖(tu)(tu)S3）。與(yu)(yu)(yu)圖(tu)(tu)7B相(xiang)比，與(yu)(yu)(yu)精漿混合的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)質(zhi)體(ti)(ti)系統地(di)呈現出比天(tian)然(ran)脂(zhi)(zhi)質(zhi)體(ti)(ti)更致(zhi)密的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)核心。這些新結(jie)(jie)構(gou)(gou)可(ke)能是由于BSP蛋白滲透(tou)到界面層而導(dao)致(zhi)膜破裂(lie)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)結(jie)(jie)果，從而導(dao)致(zhi)TEM對(dui)比度的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)改(gai)變。

圖(tu)7。（A）低密(mi)度(du)脂蛋白(bai)，（B）脂質體，（C）低密(mi)度(du)脂蛋白(bai)和精漿（精漿中的比(bi)例為0.17 mg PC/mg BSP蛋白(bai)質）和（D）脂質體和精漿（精漿中的比(bi)例為0.16 mg PC脂質體/mg BSP蛋白(bai)質）的冷(leng)凍(dong)電鏡(jing)圖(tu)像。

4、討論

4.1.BSP蛋白的表面性質及其可能的生物學作用

張力測定結(jie)果顯(xian)示精(jing)漿中含有(you)表面(mian)活(huo)性(xing)(xing)(xing)成(cheng)分(fen)。這些(xie)很(hen)可(ke)(ke)(ke)能是蛋白質(zhi)(zhi)，因為它(ta)(ta)(ta)們(men)(men)(men)構(gou)成(cheng)精(jing)漿的(de)(de)(de)(de)(de)主(zhu)要部分(fen)。它(ta)(ta)(ta)們(men)(men)(men)由(you)幾個親(qin)水(shui)性(xing)(xing)(xing)和疏(shu)水(shui)性(xing)(xing)(xing)域組(zu)成(cheng)[5]，賦予它(ta)(ta)(ta)們(men)(men)(men)兩親(qin)性(xing)(xing)(xing)。考(kao)慮到生物學背景，我們(men)(men)(men)可(ke)(ke)(ke)以(yi)假設BSP蛋白能夠到達磷(lin)(lin)脂覆蓋(gai)的(de)(de)(de)(de)(de)界面(mian)，這是由(you)于它(ta)(ta)(ta)們(men)(men)(men)與PC的(de)(de)(de)(de)(de)相互作用(yong)(yong)和自(zi)身的(de)(de)(de)(de)(de)表面(mian)活(huo)性(xing)(xing)(xing)。這可(ke)(ke)(ke)以(yi)解釋為什么這個過程很(hen)快[42]。將肽或(huo)蛋白質(zhi)(zhi)插(cha)入磷(lin)(lin)脂單分(fen)子膜通常在(zai)比凝聚域更(geng)可(ke)(ke)(ke)壓縮(suo)的(de)(de)(de)(de)(de)流(liu)(liu)體(ti)域中進行(xing)[43]。34歲(sui)?C、流(liu)(liu)體(ti)域由(you)血漿鹵素和不飽和磷(lin)(lin)脂酰膽堿組(zu)成(cheng)[35]。因此，根(gen)據前面(mian)提到的(de)(de)(de)(de)(de)涉及(ji)疏(shu)水(shui)腔的(de)(de)(de)(de)(de)機制，BSP蛋白可(ke)(ke)(ke)以(yi)很(hen)容易地(di)穿透這些(xie)流(liu)(liu)體(ti)結(jie)構(gou)域，在(zai)這些(xie)流(liu)(liu)體(ti)結(jie)構(gou)域中它(ta)(ta)(ta)們(men)(men)(men)可(ke)(ke)(ke)以(yi)立即與含有(you)磷(lin)(lin)酸(suan)膽堿的(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)子相互作用(yong)(yong)[11,12,34,42,44–46]。吸附(fu)(fu)的(de)(de)(de)(de)(de)BSP量可(ke)(ke)(ke)能受到流(liu)(liu)體(ti)域可(ke)(ke)(ke)壓縮(suo)性(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)限制。綜(zong)上所述(shu)，BSP蛋白質(zhi)(zhi)一旦被吸附(fu)(fu)，由(you)于其(qi)表面(mian)性(xing)(xing)(xing)質(zhi)(zhi)（我們(men)(men)(men)的(de)(de)(de)(de)(de)工作）、構(gou)象重排(pai)[47]以(yi)及(ji)它(ta)(ta)(ta)們(men)(men)(men)與膜組(zu)件的(de)(de)(de)(de)(de)強烈相互作用(yong)(yong)[48]，仍然固定在(zai)界面(mian)上。

4.2.脂質體和低密度脂蛋白在分離BSP蛋白中的作用

我們(men)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)結(jie)果(guo)表(biao)明，只要使用(yong)合(he)適的(de)(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)(ti)/BSP比(bi)(bi)(bi)(bi)例(li)，脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)(ti)就可(ke)以像(xiang)LDL一(yi)樣有(you)效地阻(zu)止(zhi)BSP蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)到達界面。對于(yu)低(di)密(mi)度脂(zhi)(zhi)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)，我們(men)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)模(mo)型顯示(shi)，低(di)溫保存中(zhong)(zhong)(zhong)常用(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)BSP/LDL比(bi)(bi)(bi)(bi)率(lv)（10:1 w/w）非常接(jie)近最佳值，以完全(quan)防止(zhi)BSP蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)影響(xiang)單層(ceng)(ceng)(ceng)。低(di)密(mi)度脂(zhi)(zhi)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)組(zu)織(zhi)中(zhong)(zhong)(zhong)PC/BSP與(yu)(yu)PC的(de)(de)(de)(de)(de)(de)比(bi)(bi)(bi)(bi)率(lv)為(wei)(wei)0.17 mg磷脂(zhi)(zhi)酰(xian)膽堿，1 mg精(jing)(jing)漿(jiang)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)。同樣，脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)最佳比(bi)(bi)(bi)(bi)例(li)PC/BSP為(wei)(wei)0.16 mg磷脂(zhi)(zhi)酰(xian)膽堿和(he)1 mg精(jing)(jing)漿(jiang)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)。知道卵子(zi)(zi)中(zhong)(zhong)(zhong)PC的(de)(de)(de)(de)(de)(de)比(bi)(bi)(bi)(bi)例(li)可(ke)能(neng)取決于(yu)喂食情況(kuang)，不(bu)(bu)同批(pi)次的(de)(de)(de)(de)(de)(de)LDL中(zhong)(zhong)(zhong)PC的(de)(de)(de)(de)(de)(de)比(bi)(bi)(bi)(bi)例(li)可(ke)能(neng)不(bu)(bu)同，因(yin)(yin)此(ci)這(zhe)些(xie)(xie)比(bi)(bi)(bi)(bi)例(li)被認為(wei)(wei)是相(xiang)等的(de)(de)(de)(de)(de)(de)。該比(bi)(bi)(bi)(bi)率(lv)與(yu)(yu)LDL或脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)隔(ge)離結(jie)構無關的(de)(de)(de)(de)(de)(de)事實表(biao)明，LDL中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)載脂(zhi)(zhi)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)不(bu)(bu)與(yu)(yu)BSP結(jie)合(he)，盡管這(zhe)種結(jie)合(he)是可(ke)能(neng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)[26,49]。更引(yin)人(ren)注目的(de)(de)(de)(de)(de)(de)是，這(zhe)一(yi)結(jie)果(guo)表(biao)明PC作為(wei)(wei)LDL中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)單層(ceng)(ceng)(ceng)或脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)(ti)中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)雙(shuang)層(ceng)(ceng)(ceng)組(zu)裝沒(mei)有(you)影響(xiang)。在(zai)低(di)密(mi)度脂(zhi)(zhi)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)情況(kuang)下，磷脂(zhi)(zhi)占據(ju)外層(ceng)(ceng)(ceng)單層(ceng)(ceng)(ceng)，并(bing)(bing)且(qie)所有(you)這(zhe)些(xie)(xie)磷脂(zhi)(zhi)都可(ke)被蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)接(jie)近。相(xiang)反，只有(you)形成(cheng)單層(ceng)(ceng)(ceng)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)雙(shuang)層(ceng)(ceng)(ceng)外小葉的(de)(de)(de)(de)(de)(de)磷脂(zhi)(zhi)真正與(yu)(yu)BSP蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)直接(jie)接(jie)觸。由于(yu)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)(ti)和(he)低(di)密(mi)度脂(zhi)(zhi)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)絡(luo)合(he)比(bi)(bi)(bi)(bi)率(lv)相(xiang)同，并(bing)(bing)且(qie)PCP分(fen)子(zi)(zi)（74%）也(ye)構成(cheng)雙(shuang)層(ceng)(ceng)(ceng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)內小葉，因(yin)(yin)此(ci)這(zhe)些(xie)(xie)分(fen)子(zi)(zi)也(ye)參與(yu)(yu)BSP蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)絡(luo)合(he)。與(yu)(yu)BSP蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)易于(yu)插入疏水膜(mo)相(xiang)一(yi)致，這(zhe)些(xie)(xie)BSP蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)可(ke)向(xiang)內小葉遷(qian)移，并(bing)(bing)誘(you)導(dao)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)(ti)雙(shuang)層(ceng)(ceng)(ceng)破裂(lie)/融(rong)合(he)，如TEM所觀(guan)察到的(de)(de)(de)(de)(de)(de)。然而，樣品中(zhong)(zhong)(zhong)LDL和(he)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)結(jie)構變化并(bing)(bing)不(bu)(bu)普遍(bian)，BSP蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)可(ke)以認為(wei)(wei)主要錨定(ding)在(zai)LDL和(he)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)面。當(dang)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)(ti)與(yu)(yu)BSP的(de)(de)(de)(de)(de)(de)比(bi)(bi)(bi)(bi)例(li)高于(yu)本(ben)文所研究的(de)(de)(de)(de)(de)(de)比(bi)(bi)(bi)(bi)例(li)時，BSP1（BSP家(jia)族中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)主要蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)）誘(you)導(dao)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)小泡的(de)(de)(de)(de)(de)(de)伸長和(he)珠項鏈狀(zhuang)結(jie)構的(de)(de)(de)(de)(de)(de)形成(cheng)，這(zhe)些(xie)(xie)結(jie)構演變為(wei)(wei)小泡或線狀(zhuang)結(jie)構[50]。

5、結論

首先，表面(mian)(mian)(mian)張力(li)測(ce)量證(zheng)明牛精(jing)(jing)漿具有(you)很好(hao)的(de)(de)表面(mian)(mian)(mian)活性(xing)，可能(neng)與BSP蛋白(bai)(bai)有(you)關。其(qi)次，Langmuir膜法（先前被(bei)證(zheng)明是(shi)公牛精(jing)(jing)子外細(xi)胞膜的(de)(de)相(xiang)關脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)單層模型[35]）有(you)助(zhu)于(yu)表征BSP蛋白(bai)(bai)對脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)膜的(de)(de)親和(he)(he)力(li)。BSP蛋白(bai)(bai)能(neng)夠到達(da)被(bei)磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)覆蓋的(de)(de)牛精(jing)(jing)子細(xi)胞表面(mian)(mian)(mian)，這得(de)益于(yu)它們(men)與磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酰(xian)膽堿(jian)的(de)(de)相(xiang)互作用(yong)和(he)(he)自身(shen)的(de)(de)表面(mian)(mian)(mian)活性(xing)。我(wo)們(men)的(de)(de)假設是(shi)，由(you)于(yu)它們(men)自身(shen)的(de)(de)表面(mian)(mian)(mian)活性(xing)，它們(men)首先穿(chuan)透精(jing)(jing)子的(de)(de)外小葉，然(ran)后(hou)由(you)于(yu)與磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酰(xian)膽堿(jian)的(de)(de)強(qiang)烈相(xiang)互作用(yong)而留在(zai)那里。最(zui)后(hou)，利用(yong)Langmuir膜法對已知的(de)(de)BSP蛋白(bai)(bai)螯(ao)合(he)(he)劑(ji)如ldl和(he)(he)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)體的(de)(de)作用(yong)進行了篩(shai)選(xuan)(xuan)。脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)體與低(di)密(mi)度脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)蛋白(bai)(bai)一樣有(you)效地阻止BSP蛋白(bai)(bai)插入磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)層。低(di)密(mi)度脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)蛋白(bai)(bai)和(he)(he)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)體的(de)(de)比(bi)例相(xiang)同：0.16–0.17 mg磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酰(xian)膽堿(jian)/mg BSP。我(wo)們(men)還(huan)不知道在(zai)冷凍保存(cun)的(de)(de)時間(jian)尺度上(shang)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)體的(de)(de)非(fei)常微弱的(de)(de)插入是(shi)否(fou)有(you)一些(xie)生物學后(hou)果(guo)。需要進一步研究分析每種(zhong)BSP蛋白(bai)(bai)的(de)(de)表面(mian)(mian)(mian)性(xing)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)及(ji)其(qi)在(zai)膜上(shang)的(de)(de)作用(yong)。此(ci)外，可以(yi)測(ce)試Langmuir膜，以(yi)檢測(ce)BSP與膜的(de)(de)親和(he)(he)力(li)隨(sui)溫度的(de)(de)變化[20]。最(zui)后(hou)，Langmuir膜法是(shi)一種(zhong)有(you)效的(de)(de)篩(shai)選(xuan)(xuan)BSP蛋白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)新螯(ao)合(he)(he)劑(ji)的(de)(de)方(fang)法。該方(fang)法可適(shi)用(yong)于(yu)其(qi)他(ta)動(dong)物物種(zhong)。

致謝

作者感謝IMV Technologies（法(fa)國）的(de)財務支持，Gérard Chatagnon負(fu)(fu)責精漿蛋白質定(ding)量，Véronique Solé負(fu)(fu)責凝膠電泳，Maureen Collobert負(fu)(fu)責英(ying)語(yu)校正(zheng)，Alain Sire和Patrice Papineau負(fu)(fu)責手套箱(xiang)的(de)構思(si)和實現，允許在受控大氣中使用朗繆爾槽。