摘要

開發對(dui)(dui)宿主(zhu)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)具有(you)良好生(sheng)物(wu)(wu)相(xiang)容性(xing)(xing)但對(dui)(dui)癌細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)具有(you)高效(xiao)力的(de)(de)(de)功能性(xing)(xing)生(sheng)物(wu)(wu)材(cai)(cai)料(liao)和(he)(he)(he)藥物(wu)(wu)是(shi)一(yi)項具有(you)挑戰性(xing)(xing)的(de)(de)(de)工作(zuo)。通(tong)過利用(yong)天然(ran)抗菌肽(tai)(tai)(tai)和(he)(he)(he)a-螺旋(xuan)蛋白的(de)(de)(de)優(you)勢(shi)特性(xing)(xing)，我們設計了(le)一(yi)類新的(de)(de)(de)短a-螺旋(xuan)肽(tai)(tai)(tai)G（IIKK）nI-NH2（n細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)）。我們表(biao)明，含有(you)?n1e4的(de)(de)(de)肽(tai)(tai)(tai)具有(you)不同(tong)的(de)(de)(de)效(xiao)力和(he)(he)(he)對(dui)(dui)癌癥?3和(he)(he)(he)4的(de)(de)(de)高選(xuan)擇(ze)(ze)性(xing)(xing)，能夠(gou)有(you)效(xiao)殺(sha)死(si)癌細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，同(tong)時在(zai)其(qi)工作(zuo)濃度下對(dui)(dui)宿主(zhu)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)保持良性(xing)(xing)，通(tong)過類似于殺(sha)菌效(xiao)果的(de)(de)(de)機械過程。細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)高選(xuan)擇(ze)(ze)性(xing)(xing)可能源于它(ta)們優(you)先與(yu)帶有(you)負(fu)電(dian)荷和(he)(he)(he)高流動(dong)性(xing)(xing)的(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)外膜結合。除了(le)快(kuai)速透膜能力外，這(zhe)些(xie)(xie)肽(tai)(tai)(tai)還(huan)(huan)可以(yi)通(tong)過線粒體(ti)途徑和(he)(he)(he)死(si)亡受體(ti)途徑誘導(dao)癌細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)程序性(xing)(xing)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)死(si)亡，而(er)不會(hui)誘導(dao)非特異性(xing)(xing)免(mian)疫原性(xing)(xing)反應。重要的(de)(de)(de)是(shi)，這(zhe)些(xie)(xie)肽(tai)(tai)(tai)還(huan)(huan)可以(yi)在(zai)小鼠異種移植(zhi)模型中抑制腫瘤生(sheng)長，而(er)不會(hui)引(yin)起副作(zuo)用(yong)。雖然(ran)這(zhe)項研究(jiu)揭示了(le)這(zhe)些(xie)(xie)肽(tai)(tai)(tai)作(zuo)為強效(xiao)藥物(wu)(wu)和(he)(he)(he)其(qi)他(ta)醫療保健應用(yong)的(de)(de)(de)臨床潛力，但它(ta)也指出(chu)了(le)基礎材(cai)(cai)料(liao)研究(jiu)在(zai)高選(xuan)擇(ze)(ze)性(xing)(xing)肽(tai)(tai)(tai)功能材(cai)(cai)料(liao)未來發展中的(de)(de)(de)重要性(xing)(xing)。

1.導言

尋找高效低毒(du)副作(zuo)用(yong)(yong)的(de)(de)新藥(yao)已成為功能性生物(wu)(wu)材(cai)料研(yan)究(jiu)的(de)(de)重(zhong)(zhong)要方向。盡(jin)管治(zhi)療(liao)(liao)方法(fa)取得了巨大(da)進步(bu)，但癌(ai)癥仍(reng)然(ran)是(shi)全世(shi)界致死的(de)(de)主要原(yuan)因。化療(liao)(liao)是(shi)目前治(zhi)療(liao)(liao)的(de)(de)主要策略之一，尤(you)其(qi)是(shi)對(dui)于(yu)那些處于(yu)晚(wan)期或轉移階段的(de)(de)患者[1]。然(ran)而(er)，對(dui)正(zheng)常(chang)細胞(bao)和(he)組(zu)織的(de)(de)嚴重(zhong)(zhong)副作(zuo)用(yong)(yong)以(yi)及癌(ai)細胞(bao)容易獲得多藥(yao)耐藥(yao)性往往與常(chang)規化療(liao)(liao)藥(yao)物(wu)(wu)密切相關。因此，開(kai)(kai)發(fa)(fa)對(dui)正(zheng)常(chang)宿(su)主細胞(bao)具(ju)有低毒(du)性的(de)(de)新型(xing)抗癌(ai)藥(yao)物(wu)(wu)和(he)不利于(yu)耐藥(yao)性的(de)(de)獨特作(zuo)用(yong)(yong)模(mo)式代表了開(kai)(kai)發(fa)(fa)更有效抗癌(ai)材(cai)料的(de)(de)新方向。這一領域的(de)(de)進展(zhan)可能會在醫療(liao)(liao)保(bao)健和(he)治(zhi)療(liao)(liao)策略方面開(kai)(kai)辟新的(de)(de)應用(yong)(yong)領域。

一段時(shi)間以(yi)來，天然抗(kang)(kang)(kang)菌肽（AMPs）及其合成(cheng)(cheng)類(lei)似物(wu)(wu)一直被視為新(xin)抗(kang)(kang)(kang)生(sheng)素的(de)(de)(de)(de)潛在來源。AMP對(dui)廣(guang)泛的(de)(de)(de)(de)微生(sheng)物(wu)(wu)表(biao)現(xian)(xian)出不(bu)(bu)同(tong)的(de)(de)(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)菌活性(xing)(xing)，有(you)趣的(de)(de)(de)(de)是，其中(zhong)一些(xie)還表(biao)現(xian)(xian)出對(dui)癌(ai)細胞(bao)的(de)(de)(de)(de)毒(du)(du)性(xing)(xing)，但對(dui)正(zheng)常(chang)哺乳動物(wu)(wu)細胞(bao)的(de)(de)(de)(de)生(sheng)物(wu)(wu)相(xiang)容性(xing)(xing)程度不(bu)(bu)同(tong)[2e4]。此外，由(you)(you)于(yu)這些(xie)AMP主要(yao)通過(guo)非受體(ti)介(jie)導(dao)的(de)(de)(de)(de)途徑作(zuo)用于(yu)靶細胞(bao)膜，與傳統化療(liao)藥物(wu)(wu)相(xiang)比，癌(ai)細胞(bao)更難(nan)產(chan)生(sheng)耐藥性(xing)(xing)[3,4]。由(you)(you)于(yu)這些(xie)理想(xiang)的(de)(de)(de)(de)特(te)性(xing)(xing)，研究(jiu)和開發具有(you)癌(ai)細胞(bao)毒(du)(du)性(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)AMPs可能(neng)會在開發更好的(de)(de)(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)癌(ai)藥物(wu)(wu)方面取得進(jin)一步進(jin)展。短的(de)(de)(de)(de)線性(xing)(xing)陽離子AMP在與其靶相(xiang)互作(zuo)用時(shi)折(zhe)疊成(cheng)(cheng)兩親構象，代表(biao)了抗(kang)(kang)(kang)菌肽的(de)(de)(de)(de)一種特(te)別成(cheng)(cheng)功(gong)的(de)(de)(de)(de)結(jie)構安排[5e7]。為了提高其在治療(liao)應用中(zhong)的(de)(de)(de)(de)前景，并(bing)研究(jiu)結(jie)構活性(xing)(xing)關(guan)系，已(yi)經設(she)計和合成(cheng)(cheng)了許多類(lei)似物(wu)(wu)，以(yi)模擬天然AMPs的(de)(de)(de)(de)特(te)征(zheng)，并(bing)有(you)不(bu)(bu)同(tong)的(de)(de)(de)(de)成(cheng)(cheng)功(gong)報道。主要(yao)障礙(ai)在于(yu)調整針對(dui)宿主細胞(bao)的(de)(de)(de)(de)毒(du)(du)性(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)效力。

為了(le)模(mo)擬(ni)AMPs和含(han)有簡(jian)(jian)單(dan)a-螺旋(xuan)重復(fu)序(xu)列的(de)(de)(de)(de)蛋白(bai)質(zhi)的(de)(de)(de)(de)結構(gou)(gou)功能(neng)特征，我們最近(jin)開發了(le)一類含(han)有簡(jian)(jian)單(dan)序(xu)列重復(fu)序(xu)列的(de)(de)(de)(de)短陽(yang)離子肽，G（IIKK）nI-NH2（n?1e4）[8]。IIKK模(mo)塊在與(yu)兩親膜接觸時促進(jin)a-螺旋(xuan)結構(gou)(gou)，并且(qie)隨著n的(de)(de)(de)(de)增(zeng)加(jia)，其結構(gou)(gou)傾向性(xing)(xing)提高。C端(duan)的(de)(de)(de)(de)額外(wai)I殘基穩定(ding)了(le)分(fen)子，進(jin)一步促進(jin)了(le)二(er)級結構(gou)(gou)的(de)(de)(de)(de)反應性(xing)(xing)；COO的(de)(de)(de)(de)C端(duan)電(dian)荷阻(zu)斷在觸發初始響應和隨后的(de)(de)(de)(de)選(xuan)擇性(xing)(xing)調(diao)節以響應不同的(de)(de)(de)(de)外(wai)膜表面時非常敏感(gan)。因此(ci)，它們對抗(kang)天(tian)然AMP和療法的(de)(de)(de)(de)性(xing)(xing)能(neng)需要實(shi)驗驗證(zheng)。

我們(men)發現這些(xie)短合成肽具有很強的(de)(de)抗(kang)癌活性(xing)(xing)。為(wei)了(le)探索(suo)其實(shi)(shi)際相關性(xing)(xing)，我們(men)利用(yong)成人皮膚真(zhen)皮成纖維(wei)細胞（HDFa）進行了(le)選擇性(xing)(xing)評估，采用(yong)了(le)我們(men)之前使(shi)用(yong)NIH 3T3細胞系作為(wei)宿主(zhu)細胞開發的(de)(de)培養實(shi)(shi)驗方(fang)法[8]。雖然我們(men)在這里的(de)(de)主(zhu)要目的(de)(de)是(shi)研究與所設計的(de)(de)肽的(de)(de)細胞選擇性(xing)(xing)和抗(kang)癌活性(xing)(xing)相關的(de)(de)機械過程，但本(ben)研究也檢查了(le)它們(men)對人類淋巴(ba)細胞的(de)(de)免疫原性(xing)(xing)反應及其對裸(luo)鼠(shu)異種移植瘤的(de)(de)治療效果。

2.材料和方法

2.1.化學試劑與細胞培養

Rink amide MBHA樹脂(zhi)、受保護氨基(ji)(ji)(ji)酸以及用于肽合成的(de)其他試劑和(he)(he)溶劑從(cong)德國(guo)勞埃德生化(hua)有限(xian)公司(si)（中國(guo)上海）購買。3-（4,5-二甲(jia)基(ji)(ji)(ji)噻唑-2-基(ji)(ji)(ji)）-2,5-二苯(ben)基(ji)(ji)(ji)四(si)(si)氮唑溴(xiu)化(hua)銨（MTT）、鈣黃綠素乙(yi)酰氧基(ji)(ji)(ji)甲(jia)酯（鈣黃綠素AM）、4,6-二氨基(ji)(ji)(ji)-2-苯(ben)基(ji)(ji)(ji)吲哚（DAPI）和(he)(he)異硫氰酸熒光素（FITC）-甲(jia)環素從(cong)西(xi)格瑪(ma)（密(mi)蘇(su)里州(zhou)圣路易斯）獲得(de)。5,50,6,60-四(si)(si)氯(lv)-1,10,3,30-四(si)(si)乙(yi)基(ji)(ji)(ji)苯(ben)并咪唑碳菁碘(dian)（JC-1）、抗Cyt c單抗體(ti)（小(xiao)鼠，IgG2b）和(he)(he)FITC標(biao)記(ji)的(de)山(shan)羊抗小(xiao)鼠二級(ji)抗體(ti)購自Beyotime Biotechnology（江蘇(su)，中國(guo)）。所有實驗中使(shi)用的(de)水都是經過密(mi)理(li)博(bo)密(mi)理(li)Q去離子處理(li)的(de)（18.2μcm）。

HeLa（人(ren)宮頸癌細胞(bao)）和HL60（人(ren)早幼粒細胞(bao)白血(xue)病細胞(bao)）由上(shang)海(hai)細胞(bao)生物學研究所細胞(bao)庫提供。成人(ren)真皮成纖(xian)維細胞(bao)（HDFa）是從體外獲(huo)得的(de)。癌細胞(bao)系在(zai)含有10%熱滅活FBS（胎牛血(xue)清）的(de)IMDM（Iscove改(gai)良(liang)的(de)Dulbecco培(pei)養(yang)(yang)(yang)基）中培(pei)養(yang)(yang)(yang)，而原代HDFa細胞(bao)在(zai)補(bu)(bu)充(chong)(chong)了LSGS（低血(xue)清生長補(bu)(bu)充(chong)(chong)劑）和抗生素(su)（阿莫西林和青霉素(su)）的(de)M106培(pei)養(yang)(yang)(yang)基中培(pei)養(yang)(yang)(yang)，溫度為37℃，二氧化碳濃度為5%。

用(yong)(yong)標(biao)準的菲科爾(er)法從全血細(xi)(xi)胞中分離人淋(lin)巴(ba)細(xi)(xi)胞。簡而言之，用(yong)(yong)10毫(hao)升PBS稀(xi)釋(shi)從健康志愿者獲得的10毫(hao)升血液(ye)(ye)(ye)，然后(hou)(hou)將稀(xi)釋(shi)后(hou)(hou)的血液(ye)(ye)(ye)小心地添加到1.077克/毫(hao)升的Ficoll溶液(ye)(ye)(ye)中，Ficoll與(yu)血液(ye)(ye)(ye)的比例為2:1。在(zai)2000 rpm下離心15分鐘(zhong)后(hou)(hou)，在(zai)不接觸Ficoll溶液(ye)(ye)(ye)的情況下收集含有淋(lin)巴(ba)細(xi)(xi)胞的環。淋(lin)巴(ba)細(xi)(xi)胞用(yong)(yong)PBS洗滌至少三次(ci)，然后(hou)(hou)懸(xuan)浮在(zai)PBS中使用(yong)(yong)。

通過(guo)1000 g離(li)心從血液中(zhong)分離(li)人類紅細胞（h-RBC），用PBS洗滌三次(ci)，然后在PBS中(zhong)懸浮(fu)至8%（v/v）以供使用。

2.2.肽合成

G（IIKK）nI-NH2（n?1e4）肽是使(shi)用商用CEM Liberty肽合(he)成(cheng)器，使(shi)用標準的Fmoc固(gu)(gu)相肽合(he)成(cheng)程(cheng)序制備的。在Rink酰胺(an)MBHA樹(shu)脂上從C端到N端進行合(he)成(cheng)，從而產(chan)(chan)生(sheng)C端酰胺(an)化肽。更多細節，包(bao)括(kuo)樹(shu)脂的脫保護、偶聯和切割，已在前(qian)面描述[9e11]。請注意(yi)，N端FITC標記(ji)的G（IIKK）3I-NH2也是通過(guo)固(gu)(gu)相化學合(he)成(cheng)的，我們之(zhi)前(qian)的工(gong)作[8]中報(bao)告了詳細的步驟。在旋轉(zhuan)蒸發后(hou)，通過(guo)冷乙(yi)醚沉淀至(zhi)少八(ba)次純(chun)化粗肽產(chan)(chan)品(pin)，然(ran)后(hou)冷凍(dong)干燥(zao)2天。HPLC和MS分析表明，最(zui)終產(chan)(chan)物純(chun)度高(gao)（>95%）。 

2.3.細胞毒性試驗

MTT法檢測這些肽(tai)(tai)的(de)體外細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)毒(du)性(xing)。簡單地說，癌癥或HDFa細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)（w1105細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)/mL，100 mL）在96孔(kong)(kong)(kong)板(ban)(ban)中(zhong)預培養(yang)(yang)(yang)(yang)。培養(yang)(yang)(yang)(yang)24小時后(hou)，用100毫(hao)升(sheng)2倍稀釋肽(tai)(tai)溶液（0e50 mM）處(chu)理(li)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)并(bing)繼續培養(yang)(yang)(yang)(yang)24小時。然后(hou)向每個孔(kong)(kong)(kong)中(zhong)加(jia)入20毫(hao)升(sheng)MTT溶液（PBS中(zhong)，5 mg/mL）并(bing)培養(yang)(yang)(yang)(yang)4小時。隨(sui)后(hou)，直(zhi)接(jie)去(qu)除(chu)HeLa或HDFa細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)上清(qing)液，而對(dui)于HL60細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，以1000 rpm的(de)轉速離(li)心培養(yang)(yang)(yang)(yang)物5分(fen)鐘，然后(hou)去(qu)除(chu)上清(qing)液。向每個孔(kong)(kong)(kong)中(zhong)加(jia)入150 mL二甲基(ji)亞(ya)砜（DMSO），將孔(kong)(kong)(kong)的(de)上清(qing)液轉移到(dao)新的(de)96孔(kong)(kong)(kong)板(ban)(ban)中(zhong)，并(bing)使用微孔(kong)(kong)(kong)板(ban)(ban)讀取器（M2 e，分(fen)子裝置）記錄(lu)570 nm處(chu)的(de)吸(xi)光(guang)度。不(bu)含肽(tai)(tai)的(de)孔(kong)(kong)(kong)用于對(dui)照，不(bu)含細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)孔(kong)(kong)(kong)用于分(fen)光(guang)光(guang)度計的(de)空白。實驗至少獨立進行了三次。

通過(guo)檢測不同肽(tai)存(cun)在(zai)時h-RBC的(de)(de)(de)(de)(de)血紅蛋白(bai)釋(shi)放來測定肽(tai)的(de)(de)(de)(de)(de)溶(rong)血活性(xing)。將(jiang)來自健康志愿者的(de)(de)(de)(de)(de)h-RBC洗滌(di)三次，并以(yi)8%（v/v）懸浮在(zai)PBS中(zhong)(zhong)。將(jiang)100毫升2折疊肽(tai)溶(rong)液(ye)(ye)添加到(dao)(dao)96孔(kong)無菌板中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)孔(kong)中(zhong)(zhong)。然(ran)(ran)后將(jiang)等分（100 mL）的(de)(de)(de)(de)(de)h-RBC懸浮液(ye)(ye)添加到(dao)(dao)孔(kong)中(zhong)(zhong)，以(yi)獲得200 mL的(de)(de)(de)(de)(de)總(zong)體(ti)積。在(zai)37℃下將(jiang)培(pei)養皿培(pei)養1 h，然(ran)(ran)后在(zai)1000 g下離心5 min。將(jiang)等分（100 mL）的(de)(de)(de)(de)(de)上清液(ye)(ye)轉移到(dao)(dao)新的(de)(de)(de)(de)(de)96孔(kong)培(pei)養皿中(zhong)(zhong)，通過(guo)測量540nm處的(de)(de)(de)(de)(de)吸光度來監測血紅蛋白(bai)的(de)(de)(de)(de)(de)釋(shi)放。以(yi)PBS和(he)0.1%Triton X-100中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)血紅蛋白(bai)釋(shi)放值(zhi)作為(wei)陰性(xing)和(he)陽性(xing)對照。

2.4.G（IIKK）3I-NH2的細胞選擇性

為了在(zai)體外評估G（IIKK）3I-NH2的(de)選擇(ze)性(xing)相互作用，將FITC-G（IIKK）3I-NH2加入含有原代(dai)細(xi)胞（HDFa）和腫瘤細(xi)胞（HL60）的(de)共(gong)培養系(xi)統（8孔板），最終(zhong)肽濃度為20 mM。在(zai)37C和5%CO2孵育1小時并采用適當的(de)分離程序(xu)（詳細(xi)程序(xu)見參考(kao)文獻8）后，用徠(lai)卡DMI3000熒光顯微(wei)鏡觀察(cha)兩(liang)種細(xi)胞中的(de)肽分布。

2.5.肽對不同脂質單分子膜的滲透

在(zai)(zai)(zai)多孔板Kibron微槽(cao)X（Kibron Inc.，芬蘭赫(he)爾(er)(er)辛基(ji)）中(zhong)跟蹤肽(tai)(tai)滲透(tou)到不(bu)(bu)同(tong)的(de)(de)脂質(zhi)單層(ceng)。表(biao)面壓力（p）通過使(shi)用連(lian)接到Delta-Pi微天平(ping)（芬蘭赫(he)爾(er)(er)辛基(ji)Kibron公司）的(de)(de)Wilhelmy板進行監測(ce)。氯仿(fang)中(zhong)的(de)(de)脂質(zhi)溶(rong)液(ye)(ye)在(zai)(zai)(zai)空氣緩沖界面（10 mM TriseHCl，154 mM NaCl，pH 7.4）擴散(san)。在(zai)(zai)(zai)不(bu)(bu)同(tong)初始表(biao)面壓力（pi，范圍為(wei)10至40 mN/m）下進行溶(rong)劑蒸發和單層(ceng)平(ping)衡后，將肽(tai)(tai)溶(rong)液(ye)(ye)注入單層(ceng)下方，亞相中(zhong)的(de)(de)最終肽(tai)(tai)濃(nong)度為(wei)3 mM。然后監測(ce)表(biao)面壓力隨時間的(de)(de)變化，并在(zai)(zai)(zai)30分(fen)鐘(zhong)內獲(huo)得(de)平(ping)衡表(biao)面壓力（pt）。為(wei)了比較(jiao)G（IIKK）3I-NH2穿透(tou)飽和（DPPC）和不(bu)(bu)飽和（POPC）磷脂單分(fen)子膜的(de)(de)能力，初始表(biao)面壓力保持在(zai)(zai)(zai)30 mN/m左右。所有(you)測(ce)量均在(zai)(zai)(zai)201C下進行。

2.6.G（IIKK）3I-NH2在HeLa細胞中的定位

將HeLa細(xi)(xi)胞（w1105細(xi)(xi)胞/mL）預先接種在(zai)6孔板中24小時，然(ran)后將FITC-G（IIKK）3I-NH2以10 mM的(de)最終(zhong)濃(nong)度添加到孔中。在(zai)37℃下培(pei)養1小時或24小時后，用PBS清洗細(xi)(xi)胞至(zhi)少三次。用激(ji)光共聚焦顯(xian)微鏡（Nikon AI si）觀察(cha)FITC-G（IIKK）3I-NH2在(zai)HeLa細(xi)(xi)胞中的(de)分布。

2.7.膜完整性

HeLa細(xi)(xi)胞(bao)（w1105個細(xi)(xi)胞(bao)/mL）在(zai)37C下(xia)預先接種在(zai)無菌96孔(kong)板上24小時(shi)。細(xi)(xi)胞(bao)用(yong)PBS清(qing)洗，并在(zai)37C下(xia)用(yong)鈣黃綠素(su)AM（1 mM）染色(se)30分鐘。用(yong)PBS清(qing)洗三(san)次(ci)后，向每個孔(kong)中加入100 mL PBS，并通過微孔(kong)板自動讀數器記(ji)錄熒光（在(zai)490 nm處激發，在(zai)515 nm處發射），所得(de)值作(zuo)為(wei)對照。隨后，在(zai)37C下(xia)用(yong)最終(zhong)肽濃度為(wei)10 mM的(de)G（IIKK）3I-NH2處理這些細(xi)(xi)胞(bao)不同時(shi)間(jian)（10 min 6 h）。在(zai)肽處理后，用(yong)PBS清(qing)洗細(xi)(xi)胞(bao)三(san)次(ci)，并再次(ci)記(ji)錄細(xi)(xi)胞(bao)在(zai)100 mL PBS存在(zai)下(xia)的(de)熒光。用(yong)PBS和(he)1%Triton X-100處理的(de)細(xi)(xi)胞(bao)分別作(zuo)為(wei)陰性和(he)陽性對照。

為了檢查細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)形態變化，將HeLa細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)（w1105個細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)/mL）在無菌(jun)6孔(kong)板底部的(de)蓋玻(bo)片上預(yu)接種37C 24小時(shi)。預(yu)接種的(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)在37C下(xia)用(yong)濃度為10 mM的(de)G（IIKK）3I-NH2處理(li)24小時(shi)，然后用(yong)PBS洗滌細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)兩次，用(yong)4%多聚甲醛固(gu)(gu)定15分(fen)鐘。用(yong)PBS廣泛(fan)洗滌固(gu)(gu)定的(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，并用(yong)不同濃度的(de)乙醇脫水(shui)。在臨界點干燥和用(yong)濺(jian)射鍍金機鍍金后，使用(yong)JSM-840掃(sao)描電子顯微鏡在15 kV下(xia)觀(guan)察樣(yang)品。

2.8.F-肌動蛋白、細胞核、線粒體膜電位和細胞色素c的熒光染色

對(dui)于熒(ying)光染(ran)色(se)，將HeLa細(xi)胞（w1105個細(xi)胞/mL）預(yu)先接(jie)種在6孔板中(zhong)24小(xiao)時(shi)(shi)，然后(hou)向孔中(zhong)添(tian)加最終濃(nong)度為10 mM的G（IIKK）3I-NH2。在37℃下(xia)培養24小(xiao)時(shi)(shi)后(hou)，用(yong)(yong)PBS清(qing)(qing)洗細(xi)胞，并用(yong)(yong)4%多聚甲醛固定15分(fen)鐘(zhong)。用(yong)(yong)PBS清(qing)(qing)洗固定的細(xi)胞，并在37℃下(xia)用(yong)(yong)FITC phalloidin（5 mg/mL）對(dui)其進行F-肌(ji)動蛋(dan)白染(ran)色(se)或用(yong)(yong)DAPI（6 mg/mL）對(dui)其進行核染(ran)色(se)30分(fen)鐘(zhong)。用(yong)(yong)PBS清(qing)(qing)洗后(hou)去除未結合的染(ran)料，熒(ying)光顯微鏡下(xia)觀察染(ran)色(se)細(xi)胞。

為(wei)了跟蹤線粒(li)體電位的(de)變化，肽處理的(de)HeLa細胞（本例中不使用4%多聚甲醛(quan)固定）在37C下用JC-1（10 mg/mL）染(ran)色20分(fen)鐘。然(ran)后用PBS洗滌(di)染(ran)色的(de)細胞，并用熒光顯微鏡(jing)觀(guan)察。

用(yong)(yong)(yong)抗(kang)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)色素(su)c單抗(kang)（mAb，小(xiao)鼠(shu)IgG2b）對細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)色素(su)c（Cyt-c）進行免疫熒(ying)光(guang)染色，觀察細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)色素(su)c（Cyt-c）在(zai)HeLa細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)中的(de)(de)分(fen)布。簡單地說，在(zai)用(yong)(yong)(yong)4%多聚甲醛(quan)固定后(hou)，用(yong)(yong)(yong)0.1%Triton X-100使肽處理的(de)(de)HeLa細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)通透性(xing)5分(fen)鐘，然后(hou)用(yong)(yong)(yong)封(feng)閉緩沖液（PBS中10%（v/v）胎牛血(xue)清）封(feng)閉30分(fen)鐘。在(zai)用(yong)(yong)(yong)PBS洗(xi)(xi)滌后(hou)，這(zhe)些細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)在(zai)37℃下與(yu)抗(kang)Cyt c單克隆抗(kang)體(ti)（1:50）孵(fu)(fu)育1小(xiao)時(shi)(shi)，并用(yong)(yong)(yong)PBS洗(xi)(xi)滌5分(fen)鐘以去除未結合(he)(he)的(de)(de)抗(kang)體(ti)，然后(hou)與(yu)FITC標記的(de)(de)山羊(yang)抗(kang)小(xiao)鼠(shu)二級(ji)抗(kang)體(ti)（1:100）孵(fu)(fu)育1小(xiao)時(shi)(shi)。在(zai)用(yong)(yong)(yong)PBS廣泛(fan)洗(xi)(xi)滌以去除未結合(he)(he)的(de)(de)二級(ji)抗(kang)體(ti)后(hou)，用(yong)(yong)(yong)激光(guang)共聚焦顯微鏡觀察這(zhe)些細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)。在(zai)上述所有熒(ying)光(guang)染色實驗中，未經(jing)肽處理的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)被用(yong)(yong)(yong)作對照。

2.9.DNA片段的凝膠電泳

將HeLa細(xi)胞（w1106個細(xi)胞/mL）預(yu)先接種(zhong)在(zai)無(wu)菌6孔培養(yang)皿(min)中24小(xiao)時(shi)。在(zai)37C下與10 mM G（IIKK）3I-NH2培養(yang)不同時(shi)間(jian)間(jian)隔（48、24、12和6小(xiao)時(shi)）后，收集HeLa細(xi)胞，并(bing)在(zai)37℃下用裂(lie)解(jie)(jie)緩沖液(ye)（0.8%十二烷(wan)基硫酸(suan)鈉(na)、100 mM三氯化(hua)鈉(na)、20 mM EDTA、0.15 mg/mL核(he)(he)糖(tang)核(he)(he)酸(suan)酶a、pH8.0）裂(lie)解(jie)(jie)2小(xiao)時(shi)。裂(lie)解(jie)(jie)后，裂(lie)解(jie)(jie)物在(zai)50℃下與20 mL蛋白酶K（20 mg/mL）再孵育24小(xiao)時(shi)，然后在(zai)含有(you)0.5 mg/mL溴化(hua)乙錠（EB）的(de)2%瓊(qiong)脂(zhi)糖(tang)凝(ning)膠上進(jin)行電泳。

2.10.RT-PCR（逆轉錄聚合酶鏈反應和實時聚合酶鏈反應）

為(wei)了(le)確(que)定(ding)HeLa細胞(bao)凋亡和淋巴細胞(bao)免疫效應(ying)的(de)(de)(de)相(xiang)關(guan)基(ji)因轉錄活性，進行(xing)了(le)RT-PCR檢測(ce)。簡單地說，HeLa細胞(bao)與(yu)10 mM G（IIKK）3I-NH2孵育不(bu)同的(de)(de)(de)時間(jian)(jian)間(jian)(jian)隔（1、3、6和12 h），淋巴細胞(bao)與(yu)10 mM G（IIKK）3I-NH2孵育1 h。按照制(zhi)造(zao)商的(de)(de)(de)說明(ming)（英國(guo)因維特羅根）用(yong)(yong)Trizol提取細胞(bao)總RNA。總RNA（1mg）通過隨機引物（PrimeScript逆轉錄酶，日本Takara）進行(xing)cDNA合(he)成。根據制(zhi)造(zao)商的(de)(de)(de)協議，使(shi)(shi)用(yong)(yong)power SYBR green PCR Master Mix kit（美國(guo)應(ying)用(yong)(yong)生物系(xi)(xi)統公司）和7500實(shi)時PCR系(xi)(xi)統（美國(guo)應(ying)用(yong)(yong)生物系(xi)(xi)統公司）進行(xing)實(shi)時PCR，并通過2 DDCt方(fang)法(fa)的(de)(de)(de)相(xiang)對定(ding)量(liang)分析數(shu)據。相(xiang)關(guan)基(ji)因的(de)(de)(de)轉錄水平(ping)被(bei)標準(zhun)化為(wei)管(guan)家基(ji)因b-肌動蛋白的(de)(de)(de)值。使(shi)(shi)用(yong)(yong)以下(xia)引物：b-肌動蛋白義(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)：50-ATGCAGGGTACATGTGGT-30，反(fan)(fan)(fan)義(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)：50-TCGTGCGTGACATTAAGAG-30；aspase-8義(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)：50-ATGGACTTCAGCA-GAAATCTT-30，反(fan)(fan)(fan)義(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)：50-CATGTCATCCAGTTGC-30；fas-sense:50-attatccaaagtgtta-30，反(fan)(fan)(fan)義(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)：50-tcacaatcatctt-CTG-30；fas-L義(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)：50-ATGCAGCCTTCAATT AC-30，反(fan)(fan)(fan)義(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)：50-CAATCTACAGCAAGGCAC-30；IL2義(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)：50-CaCaAttaacctCactCC TGCCAC-30，反(fan)(fan)(fan)義(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)：50-cGTTGATTCTGATTAGCTGTAGTCATCTG-30；IL8順義(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)：50-CGGAAGAACCATCCATCGTGTGG-30，反(fan)(fan)(fan)義(yi)(yi)(yi)(yi)(yi)：50-AGAATCAGAGAAG GCTGCCAAG-30。

2.11.對人宮頸癌異種移植瘤生長的抑制作用

肽(tai)(tai)，包(bao)括(kuo)G（IIKK）3I-NH2和(he)(he)G（IIKK）4I-NH2，分(fen)別(bie)表示為(wei)(wei)(wei)3#和(he)(he)4#，在無菌(jun)PBS中溶(rong)解(jie)，濃度分(fen)別(bie)為(wei)(wei)(wei)0.15 mg/mL和(he)(he)0.5 mg/mL。當腫(zhong)瘤(liu)達到(dao)平均體積100 mm3時，將PBS中的(de)100 mL人宮頸癌HeLa細胞(bao)（2106個(ge)細胞(bao)/mL）皮(pi)下接種到(dao)5至(zhi)6周齡裸鼠(shu)（BALB/c-null）的(de)腋窩中（接種后5天），將小鼠(shu)隨機分(fen)為(wei)(wei)(wei)五(wu)組（每(mei)組5只）。通過腹腔注(zhu)(zhu)射將200e250 mL制備(bei)好的(de)肽(tai)(tai)溶(rong)液注(zhu)(zhu)射到(dao)小鼠(shu)體內，最終(zhong)劑量為(wei)(wei)(wei)1.5 mg/kg或(huo)5 mg/kg，并將200e250 mL PBS注(zhu)(zhu)射作(zuo)為(wei)(wei)(wei)陰性對照(zhao)。請注(zhu)(zhu)意，我們將這一天定義為(wei)(wei)(wei)第(di)0天。注(zhu)(zhu)射每(mei)隔一天進(jin)行(xing)九次。在治療期間，每(mei)兩天測量一次小鼠(shu)的(de)腫(zhong)瘤(liu)大(da)小和(he)(he)體重。在第(di)18天，處死小鼠(shu)，移除腫(zhong)瘤(liu)，拍照(zhao)并稱(cheng)重。