摘要

神經元鈣(gai)(gai)傳感器-1（NCS1）屬于(yu)神經元鈣(gai)(gai)傳感器（NCS）蛋(dan)(dan)白(bai)家族。NCS1由四個(ge)EF-手(shou)基(ji)序(xu)和(he)一個(ge)N-末(mo)端肉(rou)(rou)豆(dou)蔻(kou)(kou)酰(xian)化(hua)組成。然而，鈣(gai)(gai)-肉(rou)(rou)豆(dou)蔻(kou)(kou)酰(xian)開(kai)關(guan)(guan)在(zai)NCS1中的(de)(de)(de)(de)(de)存在(zai)及其在(zai)膜(mo)(mo)結合(he)中的(de)(de)(de)(de)(de)作用(yong)存在(zai)爭(zheng)議。因此，Langmuir脂(zhi)質單層(ceng)模型用(yong)于(yu)模擬細(xi)胞膜(mo)(mo)，以(yi)表征NCS1的(de)(de)(de)(de)(de)膜(mo)(mo)相互(hu)作用(yong)。從單層(ceng)測量(liang)中計算出兩個(ge)結合(he)參數：最(zui)大插入壓力(li)，在(zai)該(gai)壓力(li)下蛋(dan)(dan)白(bai)質結合(he)是能(neng)量(liang)有(you)利的(de)(de)(de)(de)(de)，以(yi)及協同作用(yong)，報告與(yu)(yu)(yu)脂(zhi)質單層(ceng)的(de)(de)(de)(de)(de)吸引(yin)或(huo)排(pai)斥相互(hu)作用(yong)。在(zai)肉(rou)(rou)豆(dou)蔻(kou)(kou)酰(xian)化(hua)NCS1存在(zai)下進行的(de)(de)(de)(de)(de)結合(he)膜(mo)(mo)測量(liang)顯示，由磷酸乙醇胺極性頭基(ji)和(he)不飽和(he)脂(zhi)肪(fang)酰(xian)基(ji)鏈組成的(de)(de)(de)(de)(de)磷脂(zhi)具有(you)更好的(de)(de)(de)(de)(de)結合(he)相互(hu)作用(yong)。在(zai)沒(mei)有(you)鈣(gai)(gai)的(de)(de)(de)(de)(de)情況下，膜(mo)(mo)結合(he)測量(liang)值被徹底修改，表明(ming)蛋(dan)(dan)白(bai)質與(yu)(yu)(yu)膜(mo)(mo)的(de)(de)(de)(de)(de)結合(he)更牢固。事(shi)實上，NCS1的(de)(de)(de)(de)(de)三個(ge)EFhand基(ji)序(xu)與(yu)(yu)(yu)鈣(gai)(gai)的(de)(de)(de)(de)(de)結合(he)導(dao)致(zhi)構象變化(hua)。因此，膜(mo)(mo)上的(de)(de)(de)(de)(de)NCS1排(pai)列可(ke)以(yi)重(zhong)新排(pai)列，以(yi)更好地(di)與(yu)(yu)(yu)其基(ji)質相互(hu)作用(yong)。NCS1的(de)(de)(de)(de)(de)N末(mo)端肽由兩個(ge)參與(yu)(yu)(yu)NCS1膜(mo)(mo)相互(hu)作用(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)兩親螺旋組成。此外，肉(rou)(rou)豆(dou)蔻(kou)(kou)酰(xian)基(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)存在(zai)對NCS1的(de)(de)(de)(de)(de)膜(mo)(mo)結合(he)有(you)微弱的(de)(de)(de)(de)(de)影響，表明(ming)該(gai)蛋(dan)(dan)白(bai)質中缺乏(fa)鈣(gai)(gai)-肉(rou)(rou)豆(dou)蔻(kou)(kou)酰(xian)基(ji)開(kai)關(guan)(guan)機制(zhi)。因此，肉(rou)(rou)豆(dou)蔻(kou)(kou)酰(xian)化(hua)可(ke)能(neng)在(zai)NCS1的(de)(de)(de)(de)(de)折疊(die)/去(qu)折疊(die)中發揮所需的(de)(de)(de)(de)(de)結構作用(yong)，這對其多種生物學功(gong)能(neng)至關(guan)(guan)重(zhong)要。

1、引言

鈣信號在細(xi)胞功能中起著至關重(zhong)要的作用(yong)[1-3]。事實上，鈣是一種細(xi)胞內信使，參與多種生物(wu)過程，如神(shen)經(jing)元(yuan)(yuan)可塑性和神(shen)經(jing)傳遞[4-7]。細(xi)胞對(dui)鈣反應的多樣性由一個EF-hand鈣結合(he)蛋白家族(zu)提(ti)供(gong)，包括(kuo)神(shen)經(jing)元(yuan)(yuan)鈣傳感器（NCS）蛋白亞家族(zu)[8-10]。NCS家族(zu)有14個成員，由四個EF-手基序(xu)（兩個由短環區(qu)連接的螺(luo)旋）和一個N-末端肉豆蔻酰化(hua)共識序(xu)列組(zu)成。

在NCS家(jia)族的(de)(de)(de)蛋(dan)白質(zhi)(zhi)中(zhong)，神(shen)(shen)經(jing)(jing)鈣(gai)(gai)(gai)傳(chuan)感器-1（NCS1）在大多(duo)(duo)數神(shen)(shen)經(jing)(jing)元類型(xing)以及發(fa)育(yu)中(zhong)的(de)(de)(de)心肌(ji)細胞(bao)和(he)肥(fei)大細胞(bao)中(zhong)表達(da)[11-13]。NCS1主要定位于細胞(bao)膜(mo)，參(can)與多(duo)(duo)種功能，如促進神(shen)(shen)經(jing)(jing)遞質(zhi)(zhi)釋放(fang)[14-17]，調(diao)節磷脂酰肌(ji)醇4-激(ji)(ji)酶[18-21]的(de)(de)(de)脂質(zhi)(zhi)激(ji)(ji)酶活性和(he)調(diao)節鉀通(tong)(tong)道(dao)[22]。NCS1是一(yi)種22 kDa肉(rou)豆蔻酰化(hua)蛋(dan)白，具有四個EF-手(shou)基序，其(qi)(qi)中(zhong)EF1是隱(yin)蔽的(de)(de)(de)，因此不與鈣(gai)(gai)(gai)結合。之前已經(jing)(jing)確(que)定了鈣(gai)(gai)(gai)存在下(xia)非肉(rou)豆蔻酰化(hua)NCS1的(de)(de)(de)三維結構(gou)（圖S1）[23]。EF-hands 1-3的(de)(de)(de)鈣(gai)(gai)(gai)結合誘導蛋(dan)白質(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)構(gou)象變化(hua)，導致C-末端片段的(de)(de)(de)擠出(chu)和(he)大的(de)(de)(de)疏水裂縫的(de)(de)(de)暴(bao)露[23,24]。這種構(gou)象變化(hua)允許(xu)蛋(dan)白質(zhi)(zhi)通(tong)(tong)過其(qi)(qi)疏水裂縫結合多(duo)(duo)種底物[25-29]。

鈣-肉(rou)(rou)豆(dou)(dou)(dou)(dou)(dou)蔻(kou)(kou)基(ji)(ji)開(kai)關(guan)是一種(zhong)分(fen)子(zi)調節機制，導致肉(rou)(rou)豆(dou)(dou)(dou)(dou)(dou)蔻(kou)(kou)基(ji)(ji)在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)鈣存(cun)(cun)在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)的(de)(de)(de)(de)情(qing)(qing)況下(xia)從疏水裂縫中(zhong)(zhong)擠出[30-35]。鈣-肉(rou)(rou)豆(dou)(dou)(dou)(dou)(dou)蔻(kou)(kou)酰(xian)(xian)開(kai)關(guan)的(de)(de)(de)(de)存(cun)(cun)在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)已被(bei)(bei)證明存(cun)(cun)在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)于幾種(zhong)NCS蛋(dan)白質中(zhong)(zhong)，如recoverin、VILIP-1、VILIP-3和hippocalcin。然(ran)而(er)，存(cun)(cun)在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)鈣的(de)(de)(de)(de)非肉(rou)(rou)豆(dou)(dou)(dou)(dou)(dou)蔻(kou)(kou)酰(xian)(xian)化NCS1的(de)(de)(de)(de)三維(wei)結(jie)構(gou)不(bu)允(yun)許確認這(zhe)(zhe)(zhe)種(zhong)機制的(de)(de)(de)(de)存(cun)(cun)在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)[23]。此(ci)外(wai)，在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)NCS1中(zhong)(zhong)存(cun)(cun)在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)鈣-肉(rou)(rou)豆(dou)(dou)(dou)(dou)(dou)蔻(kou)(kou)酰(xian)(xian)開(kai)關(guan)是有(you)(you)(you)(you)爭(zheng)議的(de)(de)(de)(de)。核磁共振(zhen)(zhen)（NMR）、熒光和平衡鈣結(jie)合測量表(biao)明，芽殖酵(jiao)母(mu)的(de)(de)(de)(de)NCS1同系物(wu)（Frq1）可(ke)能(neng)(neng)具有(you)(you)(you)(you)鈣-肉(rou)(rou)豆(dou)(dou)(dou)(dou)(dou)蔻(kou)(kou)酰(xian)(xian)開(kai)關(guan)[36]。這(zhe)(zhe)(zhe)一建(jian)議得到了(le)裂變(bian)酵(jiao)母(mu)（NCS1）NCS1同系物(wu)核磁共振(zhen)(zhen)結(jie)構(gou)測定的(de)(de)(de)(de)支持(chi)[28]。事實(shi)上(shang)(shang)，Ncs1十四(si)烷基(ji)(ji)在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)沒有(you)(you)(you)(you)鈣的(de)(de)(de)(de)情(qing)(qing)況下(xia)被(bei)(bei)埋入空腔中(zhong)(zhong)，在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)有(you)(you)(you)(you)鈣的(de)(de)(de)(de)情(qing)(qing)況下(xia)被(bei)(bei)擠出。然(ran)而(er)，NCS1、NCS1和Frq1的(de)(de)(de)(de)序列不(bu)相似，可(ke)能(neng)(neng)導致結(jie)構(gou)差異（圖(tu)1）。事實(shi)上(shang)(shang)，分(fen)裂酵(jiao)母(mu)Ncs1和芽殖酵(jiao)母(mu)Frq1與(yu)(yu)哺乳動物(wu)Ncs1的(de)(de)(de)(de)同源(yuan)性分(fen)別為69.5%和60.0%。此(ci)外(wai)，結(jie)構(gou)分(fen)析允(yun)許識(shi)別NCS1 N-末端段內6個殘基(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)序，即使在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)沒有(you)(you)(you)(you)鈣的(de)(de)(de)(de)情(qing)(qing)況下(xia)，這(zhe)(zhe)(zhe)些(xie)基(ji)(ji)序也將肉(rou)(rou)豆(dou)(dou)(dou)(dou)(dou)蔻(kou)(kou)酰(xian)(xian)基(ji)(ji)鎖定在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)暴(bao)露的(de)(de)(de)(de)構(gou)象中(zhong)(zhong)[29]。這(zhe)(zhe)(zhe)6個殘基(ji)(ji)基(ji)(ji)基(ji)(ji)序（圖(tu)1中(zhong)(zhong)以紅色突(tu)出顯示）對(dui)于每個物(wu)種(zhong)都非常不(bu)同。這(zhe)(zhe)(zhe)種(zhong)差異可(ke)以解釋(shi)Frq1和Ncs1存(cun)(cun)在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)鈣-肉(rou)(rou)豆(dou)(dou)(dou)(dou)(dou)蔻(kou)(kou)酰(xian)(xian)開(kai)關(guan)，這(zhe)(zhe)(zhe)與(yu)(yu)它們的(de)(de)(de)(de)人類同源(yuan)物(wu)Ncs1不(bu)同。NCS1功能(neng)(neng)的(de)(de)(de)(de)模型強調了(le)與(yu)(yu)鈣的(de)(de)(de)(de)存(cun)(cun)在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)無關(guan)的(de)(de)(de)(de)本構(gou)膜(mo)結(jie)合[37]。此(ci)外(wai)，鈣在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)體(ti)外(wai)和神經細胞(bao)系中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)膜(mo)結(jie)合不(bu)需要鈣，這(zhe)(zhe)(zhe)表(biao)明缺乏鈣-肉(rou)(rou)豆(dou)(dou)(dou)(dou)(dou)蔻(kou)(kou)酰(xian)(xian)開(kai)關(guan)[37,38]。其他出版物(wu)使用(yong)這(zhe)(zhe)(zhe)些(xie)不(bu)同的(de)(de)(de)(de)結(jie)果來證實(shi)或否(fou)認NCS1中(zhong)(zhong)存(cun)(cun)在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)鈣-肉(rou)(rou)豆(dou)(dou)(dou)(dou)(dou)蔻(kou)(kou)酰(xian)(xian)開(kai)關(guan)[10,27,39-41]。盡管對(dui)NCS1進行了(le)大量研究，但鈣-肉(rou)(rou)豆(dou)(dou)(dou)(dou)(dou)蔻(kou)(kou)酰(xian)(xian)開(kai)關(guan)的(de)(de)(de)(de)存(cun)(cun)在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)仍有(you)(you)(you)(you)疑問(wen)，其確切機制尚待確定。

圖(tu)1.人類NCS1（橙(cheng)色）、裂變酵母NCS1（粉紅(hong)色）和芽(ya)殖酵母Frq1（藍色）的(de)(de)序列比(bi)對(dui)(dui)。在鈣(gai)存(cun)在和不存(cun)在的(de)(de)情況下(xia)，負責肉(rou)豆蔻基擠出的(de)(de)基序用紅(hong)色表(biao)示[29]（為了解釋本圖(tu)例中對(dui)(dui)顏色的(de)(de)引用，讀者請參閱(yue)本文的(de)(de)網絡版(ban)本）。

本出版物旨在(zai)(zai)(zai)(zai)研究(jiu)在(zai)(zai)(zai)(zai)鈣及(ji)其(qi)肉豆蔻酰(xian)基存(cun)(cun)在(zai)(zai)(zai)(zai)和不存(cun)(cun)在(zai)(zai)(zai)(zai)的(de)情(qing)況(kuang)下NCS1的(de)膜(mo)(mo)(mo)結合(he)，以解(jie)決當前(qian)的(de)爭議。此外，關(guan)于NCS1膜(mo)(mo)(mo)結合(he)的(de)信息很(hen)少。核(he)磁共振分配表明(ming)，在(zai)(zai)(zai)(zai)膜(mo)(mo)(mo)存(cun)(cun)在(zai)(zai)(zai)(zai)和不存(cun)(cun)在(zai)(zai)(zai)(zai)的(de)情(qing)況(kuang)下，NCS1發生結構變化[42]。此外，對(dui)兩種(zhong)不同(tong)的(de)脂(zhi)質囊(nang)泡（棕櫚酰(xian)油(you)酰(xian)基磷(lin)(lin)酸(suan)(suan)絲氨(an)酸(suan)(suan)POPS和棕櫚酰(xian)油(you)酰(xian)基磷(lin)(lin)酸(suan)(suan)膽(dan)堿POPS）進行(xing)了熒光測量，表明(ming)NCS1以鈣依賴性方(fang)式結合(he)POPS囊(nang)泡[24]。最后，免疫細胞化學數據顯示，在(zai)(zai)(zai)(zai)Triton X-100提取后獲得(de)的(de)耐(nai)去(qu)污膜(mo)(mo)(mo)（DRM）中發現少量NCS1[43]。然(ran)而，磷(lin)(lin)脂(zhi)的(de)組成對(dui)NCS1的(de)膜(mo)(mo)(mo)結合(he)的(de)影(ying)響尚未描(miao)述(shu)。在(zai)(zai)(zai)(zai)本出版物中，Langmuir脂(zhi)質單層模(mo)型用(yong)于模(mo)擬細胞膜(mo)(mo)(mo)，并(bing)確定(ding)幾種(zhong)條(tiao)件下NCS1的(de)膜(mo)(mo)(mo)結合(he)參數。

首先，研(yan)究了肉豆(dou)蔻(kou)酰化NCS1（mNCS1）在(zai)(zai)具有(you)不同磷脂單分(fen)(fen)子膜(mo)的(de)鈣(gai)存(cun)在(zai)(zai)下(xia)的(de)膜(mo)結合(he)(he)行(xing)為(wei)。這(zhe)些數據可以表征磷脂成分(fen)(fen)對(dui)蛋白質(zhi)結合(he)(he)的(de)影(ying)響。然后在(zai)(zai)沒有(you)鈣(gai)的(de)情況下(xia)進行(xing)相(xiang)同的(de)實驗，以了解構象變化對(dui)其結合(he)(he)的(de)影(ying)響。然后研(yan)究了非肉豆(dou)蔻(kou)酰化NCS1（nmNCS1）的(de)行(xing)為(wei)，以突出(chu)肉豆(dou)蔻(kou)酰基團(tuan)在(zai)(zai)存(cun)在(zai)(zai)或(huo)不存(cun)在(zai)(zai)鈣(gai)的(de)情況下(xia)的(de)作用(yong)。最后，使用(yong)一(yi)種(zhong)類似于NCS1 N末端(duan)片(pian)段的(de)肽來更(geng)好地了解其在(zai)(zai)蛋白質(zhi)膜(mo)結合(he)(he)中的(de)作用(yong)。

2、材料和方法

2.1.布料

用(yong)于制備緩沖溶(rong)液的去離子水(shui)來(lai)自(zi)Barnstead Nanopure系統（Barnstead，Dubuque，IA）。其電阻率和(he)表面(mian)張(zhang)力在20?C分別為18.2 M×cm和(he)72 mN/M。磷(lin)(lin)(lin)脂來(lai)自(zi)Avanti極性脂質（Alabaster，Al）：二(er)(er)棕櫚(lv)酰(xian)膽堿（DPPC）、二(er)(er)硬脂酰(xian)膽堿（DSPC）、二(er)(er)油(you)酰(xian)膽堿（DOPC）、二(er)(er)氧(yang)(yang)羰(tang)基六(liu)烯醇磷(lin)(lin)(lin)酸膽堿（DDPC）、二(er)(er)棕櫚(lv)酰(xian)磷(lin)(lin)(lin)酸乙(yi)(yi)醇胺(an)（DPPE）、二(er)(er)硬脂酰(xian)磷(lin)(lin)(lin)酸乙(yi)(yi)醇胺(an)（DSPE）、二(er)(er)油(you)酰(xian)磷(lin)(lin)(lin)酸乙(yi)(yi)醇胺(an)（DOPE），雙二(er)(er)十二(er)(er)碳六(liu)烯基磷(lin)(lin)(lin)酸乙(yi)(yi)醇胺(an)（DDPE）、二(er)(er)棕櫚(lv)酰(xian)磷(lin)(lin)(lin)酸絲氨(an)酸（DPPS）、二(er)(er)硬脂酰(xian)磷(lin)(lin)(lin)酸絲氨(an)酸（DSPS）、二(er)(er)油(you)酰(xian)磷(lin)(lin)(lin)酸絲氨(an)酸（DOPS）和(he)雙二(er)(er)十二(er)(er)碳六(liu)烯基磷(lin)(lin)(lin)酸絲氨(an)酸（DDPS）。CaCl2、Hepes和(he)巰(qiu)基乙(yi)(yi)醇來(lai)自(zi)西(xi)格瑪（密蘇里州圣路(lu)易斯）。KCl和(he)EGTA來(lai)自(zi)實驗(yan)室(shi)Mat（魁北克，QC）。由DO和(he)DD酰(xian)基鏈組成(cheng)的溶(rong)液在氯仿中以0.1 mg/mL的濃度(du)制備，并在氬氣下(xia)儲存(cun)，在5.5 mg/mL的抗(kang)氧(yang)(yang)化劑BHT存(cun)在下(xia)?20?C、所有(you)其他化學品均按(an)收到時使用(yong)。

2.2.NCS1的表達和純化

mNCS1和nmNCS1如(ru)前所述過表(biao)達和純化[44,45]。使(shi)用標準9-芴(wu)甲氧基(ji)羰基(ji)/二丙基(ji)碳二亞(ya)胺(an)（Fmoc/DIC）化學[46]通(tong)過固相程(cheng)序(xu)合成N-末端肽。在合成的最后(hou)一步，使(shi)用肉豆蔻(kou)酸(suan)酐和標準偶(ou)聯程(cheng)序(xu)[46]對N-末端甘氨酸(suan)進行(xing)肉豆蔻(kou)酰(xian)化。

2.3.結合參數的測量

使(shi)用(yong)DeltaPi4微張(zhang)力計和Kibron Inc.（芬蘭(lan)赫爾(er)辛基(ji)）的500L玻(bo)璃槽（2 cm2），通(tong)過(guo)Wilhelmy方法測量(liang)(liang)表(biao)(biao)面(mian)壓力（）。在(zai)(zai)每次實驗之(zhi)前，用(yong)自來水(shui)沖洗(xi)玻(bo)璃槽，然(ran)(ran)后在(zai)(zai)乙醇存在(zai)(zai)下用(yong)Q-Tip刷洗(xi)。在(zai)(zai)用(yong)去離(li)子水(shui)進行大量(liang)(liang)沖洗(xi)之(zhi)前，這(zhe)些清洗(xi)重復(fu)3次。然(ran)(ran)后通(tong)過(guo)表(biao)(biao)面(mian)抽吸干燥槽。實驗裝置(zhi)放置(zhi)在(zai)(zai)21±1的有機玻(bo)璃箱內?C帶濕度控制。亞相緩沖液(ye)包含50 mM Hepes、3 mM巰基(ji)乙醇、50 mM KCl和pH 7.2下的1 mM CaCl2或(huo)5 mM EGTA。

將(jiang)幾(ji)微升溶解在氯仿（1 mg mL）中的(de)(de)磷(lin)(lin)脂(zhi)分散成磷(lin)(lin)脂(zhi)單(dan)(dan)層(ceng)?1）直到(dao)達(da)(da)到(dao)所(suo)需的(de)(de)初始(shi)表(biao)(biao)面壓(ya)力(li)（i）。攤鋪(pu)(pu)溶劑蒸發和(he)薄膜(mo)達(da)(da)到(dao)平(ping)衡的(de)(de)等待(dai)時間隨脂(zhi)質類型、攤鋪(pu)(pu)體積、初始(shi)表(biao)(biao)面壓(ya)力(li)和(he)脂(zhi)質濃度而變(bian)化(hua)[47]。然后將(jiang)NCS1注(zhu)入該單(dan)(dan)層(ceng)下(xia)方，以達(da)(da)到(dao)274nm的(de)(de)最佳最終濃度。監(jian)測(ce)蛋白質與磷(lin)(lin)脂(zhi)單(dan)(dan)層(ceng)結(jie)合(he)的(de)(de)動力(li)學，直到(dao)在不攪拌的(de)(de)情況下(xia)（通常為3小時）達(da)(da)到(dao)平(ping)衡表(biao)(biao)面壓(ya)力(li)（e）。注(zhu)入NCS1后測(ce)得的(de)(de)表(biao)(biao)面壓(ya)力(li)增加(jia)（）對應于(yu)e–i。

結(jie)合(he)參數(shu)的計算如前所述[47,48]。簡(jian)而言之，在脂質單層的不同i值(zhi)(zhi)下進行(xing)蛋白質結(jie)合(he)測(ce)量。然(ran)后，作為i函數(shu)的圖允許通過(guo)將圖的回(hui)歸外推到x軸來確(que)(que)定(ding)最大插入壓力（MIP）。MIP的不確(que)(que)定(ding)性(xing)是根據前面(mian)描述的線性(xing)回(hui)歸實驗數(shu)據的協方(fang)差計算的[48]。事實上(shang)，這種不確(que)(que)定(ding)性(xing)已確(que)(que)定(ding)如下：回(hui)歸y=ax+b可以(yi)(yi)從的圖中(zhong)獲得(de)，作為i的函數(shu)。MIP在y=0時計算。因(yin)此(ci)，x=?b/a或i=?b/a.因(yin)此(ci)，置信(xin)區間（CI）由以(yi)(yi)下公(gong)式得(de)出：95%CI=i±1.96 Var（i），其中(zhong)1.96的值(zhi)(zhi)來自95%置信(xin)區間的標準正態（z）分布表中(zhong)的z值(zhi)(zhi)。Var（i）由delta方(fang)法確(que)(que)定(ding)，使用，

其中，Var（a）和Var（b）由標準(zhun)誤差（SE）的平方獲得，例如Var（a）=SE（a）2。使(shi)用SPSS軟件計算a和b的SE。Cov（a，b）通(tong)過使(shi)用，

其中′x是(shi)(shi)i的平(ping)均值(zhi)，而是(shi)(shi)使(shi)用(yong)SPSS軟件獲得(de)的剩余平(ping)均值(zhi)。協(xie)同值(zhi)對(dui)應(ying)于圖e的線性回(hui)歸斜率，作為圖i的函數(shu)(shu)[47]。也可以(yi)通(tong)過將的線性回(hui)歸斜率加1作為i的函數(shu)(shu)來(lai)獲得(de)[49]。使(shi)用(yong)（（e）（1）計(ji)算(suan)協(xie)同效應(ying)的不確(que)定性?r2）1/2）/（（i）（n）?2）1/2），其中是(shi)(shi)標(biao)準差(cha)，r是(shi)(shi)相關系數(shu)(shu)，n是(shi)(shi)點數(shu)(shu)。我們最近創建了一個免費的網頁，在(zai)那里(li)可以(yi)很容易地計(ji)算(suan)這些綁定參數(shu)(shu)和實(shi)驗(yan)誤(wu)差(cha)(///www.crchudequebec.ulaval.ca/BindingParametersCalculator/）。

使用以下適用于Pitcher等人[50]測量的表面(mian)壓(ya)力的拉伸指(zhi)數方(fang)程擬合蛋白質或肽在(zai)磷脂單分子膜上吸附期間記錄的表面(mian)壓(ya)力與(yu)時間的值(zhi)：?ie?（kt）ˉ，其中t是(shi)(shi)時間t時單層的表面(mian)壓(ya)力，k是(shi)(shi)速率系(xi)數，t是(shi)(shi)時間，ˉ是(shi)(shi)固(gu)定為0.001的指(zhi)數比(bi)例因子。

結果和討論

3.1.mNCS1的膜結合

細胞(bao)膜是復雜的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)脂質雙層(ceng)(ceng)，在一些(xie)生物過程(cheng)中起著(zhu)至關重要的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)作(zuo)用(yong)。此外，大(da)約25%的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)整個蛋(dan)(dan)白(bai)質組與這些(xie)膜動(dong)態相互作(zuo)用(yong)，并參(can)與其不同(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)功能(neng)[51,52]。Langmuir脂質單層(ceng)(ceng)是一種(zhong)巧(qiao)妙(miao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)模型(xing)膜系統，用(yong)于研究空氣(qi)/水界(jie)面(mian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)白(bai)質-脂質相互作(zuo)用(yong)[48,53-56]。此外，雙層(ceng)(ceng)和(he)(he)單層(ceng)(ceng)之間存在直接熱力學關系[57,58]。該(gai)(gai)模型(xing)可以(yi)(yi)(yi)通過控(kong)制不同(tong)參(can)數(shu)(shu)（如表(biao)(biao)面(mian)壓力）來表(biao)(biao)征(zheng)蛋(dan)(dan)白(bai)質吸附和(he)(he)脂質特異性(xing)。如第2.3節所述，最大(da)插(cha)入壓力（MIP）和(he)(he)協(xie)(xie)同(tong)作(zuo)用(yong)是兩(liang)(liang)個結(jie)合(he)(he)參(can)數(shu)(shu)，可以(yi)(yi)(yi)通過單層(ceng)(ceng)測量計算(suan)。MIP值是蛋(dan)(dan)白(bai)質結(jie)合(he)(he)能(neng)量有(you)(you)(you)利的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)最大(da)表(biao)(biao)面(mian)壓力。負協(xie)(xie)同(tong)值表(biao)(biao)示蛋(dan)(dan)白(bai)質與磷脂單層(ceng)(ceng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)不利結(jie)合(he)(he)，而正協(xie)(xie)同(tong)值表(biao)(biao)示有(you)(you)(you)利結(jie)合(he)(he)[47]。事實上，該(gai)(gai)參(can)數(shu)(shu)與蛋(dan)(dan)白(bai)質和(he)(he)脂質單層(ceng)(ceng)之間的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)協(xie)(xie)同(tong)作(zuo)用(yong)有(you)(you)(you)關。在有(you)(you)(you)鈣(gai)和(he)(he)無(wu)鈣(gai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)情況下，計算(suan)了mNCS1的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)這兩(liang)(liang)個參(can)數(shu)(shu)，以(yi)(yi)(yi)表(biao)(biao)征(zheng)mNCS1的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)膜結(jie)合(he)(he)以(yi)(yi)(yi)及該(gai)(gai)離子(zi)對其結(jie)合(he)(he)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)影響。

3.1.1.鈣存在下mNCS1的膜結合

為了在每次實(shi)驗中獲得最佳(jia)且可重(zhong)復的(de)(de)表(biao)面(mian)壓力變化(hua)，蛋(dan)白質(zhi)的(de)(de)量必須(xu)使脂質(zhi)單層飽和。因此，在朗繆爾槽中注入了幾種濃(nong)度的(de)(de)NCS1。平衡時的(de)(de)表(biao)面(mian)壓力值在274 nM的(de)(de)濃(nong)度下達(da)到(dao)平臺（圖S2）。該飽和濃(nong)度用于所有后續實(shi)驗。

NCS1主(zhu)要表(biao)達(da)于神經元、肥大細(xi)(xi)胞(bao)(bao)和(he)(he)心肌(ji)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)[11-13]。神經元膜(mo)由(you)(you)(you)(you)51 mol%的(de)(de)磷酸(suan)膽堿（PC）、29 mol%的(de)(de)磷酸(suan)乙醇胺（PE）和(he)(he)5 mol%的(de)(de)磷酸(suan)絲氨酸(suan)（PS）組(zu)成(cheng)(cheng)[59]。類似地，肥大細(xi)(xi)胞(bao)(bao)膜(mo)由(you)(you)(you)(you)50 mol%PC、25 mol%PE和(he)(he)15 mol%PS組(zu)成(cheng)(cheng)[60]。此外(wai)(wai)，心肌(ji)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)膜(mo)由(you)(you)(you)(you)23 mol%PC、41 mol%PE和(he)(he)8 mol%PS組(zu)成(cheng)(cheng)[61]。PE是(shi)(shi)一(yi)個(ge)(ge)(ge)(ge)較小的(de)(de)兩性離子極性頭基(ji)(ji)團，而(er)(er)PC是(shi)(shi)一(yi)個(ge)(ge)(ge)(ge)較大的(de)(de)（圖(tu)S3）。PS也比PE大，帶負電。這(zhe)三(san)個(ge)(ge)(ge)(ge)最具代表(biao)性的(de)(de)極性頭基(ji)(ji)團已用于存(cun)在不同脂(zhi)肪(fang)酰(xian)(xian)(xian)(xian)(xian)基(ji)(ji)鏈的(de)(de)情(qing)況下，以評估脂(zhi)質成(cheng)(cheng)分(fen)對NCS1膜(mo)結(jie)合的(de)(de)影響。事實上(shang)(shang)，已經選(xuan)擇了四(si)個(ge)(ge)(ge)(ge)脂(zhi)肪(fang)酰(xian)(xian)(xian)(xian)(xian)基(ji)(ji)鏈（二棕(zong)櫚酰(xian)(xian)(xian)(xian)(xian)DP、二硬脂(zhi)酰(xian)(xian)(xian)(xian)(xian)DS、二油酰(xian)(xian)(xian)(xian)(xian)基(ji)(ji)DO和(he)(he)二羰基(ji)(ji)六烯(xi)基(ji)(ji)DD）（圖(tu)S3）。細(xi)(xi)胞(bao)(bao)膜(mo)主(zhu)要由(you)(you)(you)(you)這(zhe)四(si)條脂(zhi)肪(fang)酰(xian)(xian)(xian)(xian)(xian)基(ji)(ji)鏈組(zu)成(cheng)(cheng)，這(zhe)四(si)條脂(zhi)肪(fang)酰(xian)(xian)(xian)(xian)(xian)基(ji)(ji)鏈通常占總脂(zhi)肪(fang)酰(xian)(xian)(xian)(xian)(xian)基(ji)(ji)鏈的(de)(de)60%以上(shang)(shang)。例如，心肌(ji)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)膜(mo)由(you)(you)(you)(you)14 mol%DS、27 mol%DP、16 mol%DO和(he)(he)5 mol%DD組(zu)成(cheng)(cheng)，帶有PE極性頭群[61]。DP和(he)(he)DS分(fen)別(bie)(bie)是(shi)(shi)由(you)(you)(you)(you)16個(ge)(ge)(ge)(ge)和(he)(he)18個(ge)(ge)(ge)(ge)碳組(zu)成(cheng)(cheng)的(de)(de)飽(bao)和(he)(he)脂(zhi)肪(fang)酰(xian)(xian)(xian)(xian)(xian)基(ji)(ji)鏈。DO和(he)(he)DD分(fen)別(bie)(bie)是(shi)(shi)由(you)(you)(you)(you)18個(ge)(ge)(ge)(ge)和(he)(he)22個(ge)(ge)(ge)(ge)碳組(zu)成(cheng)(cheng)的(de)(de)不飽(bao)和(he)(he)脂(zhi)肪(fang)酰(xian)(xian)(xian)(xian)(xian)基(ji)(ji)鏈。DO只有一(yi)個(ge)(ge)(ge)(ge)不飽(bao)和(he)(he)（雙(shuang)鍵），而(er)(er)DD有6個(ge)(ge)(ge)(ge)不飽(bao)和(he)(he)。這(zhe)些(xie)組(zu)成(cheng)(cheng)差異會導(dao)致幾種物(wu)理(li)狀態（液體膨脹、液體冷凝(ning)或(huo)固體冷凝(ning)），這(zhe)些(xie)物(wu)理(li)狀態會影響蛋白(bai)質的(de)(de)膜(mo)結(jie)合[49]。此外(wai)(wai)，細(xi)(xi)胞(bao)(bao)膜(mo)的(de)(de)脂(zhi)質在大多數細(xi)(xi)胞(bao)(bao)器(qi)（包括質膜(mo)）的(de)(de)膜(mo)中不對稱分(fen)布(bu)（見參考文獻[62]）。因此，Langmuir脂(zhi)質單(dan)層(ceng)模型允許獨立測定蛋白(bai)質與外(wai)(wai)膜(mo)或(huo)內(nei)膜(mo)小葉中脂(zhi)質的(de)(de)結(jie)合。因此，在鈣存(cun)在的(de)(de)12種不同磷脂(zhi)單(dan)分(fen)子膜(mo)下注射(she)了mNCS1。

確定(ding)綁定(ding)參數的(de)(de)典型示例如(ru)圖(tu)(tu)2所(suo)示。實(shi)際上，對(dui)于6.0、8.0、16.2和24.2 mN/m的(de)(de)i，分別獲得了(le)21.0、19.0、12.9和8.0 mN/m的(de)(de)（圖(tu)(tu)2插(cha)圖(tu)(tu)）。被繪制為i的(de)(de)函(han)數，導致負斜(xie)率。因此，在DPPE存在的(de)(de)情況(kuang)下，mNCS1的(de)(de)MIP值(zhi)為35.8±1.1 mN/m，協同(tong)值(zhi)為0.30±0.02。這(zhe)(zhe)種(zhong)積極(ji)的(de)(de)協同(tong)作用(yong)表明mNCS1和這(zhe)(zhe)種(zhong)脂(zhi)質單層之間發生了(le)積極(ji)的(de)(de)相互作用(yong)。然后，以(yi)不同(tong)的(de)(de)i注射(she)每種(zhong)脂(zhi)質和MIP，并根據(ju)表面壓(ya)力動力學(xue)計算協同(tong)值(zhi)。

圖2.在(zai)鈣存在(zai)下(xia)(xia)測定(ding)mNCS1與(yu)DPPE單(dan)層(ceng)結(jie)合(he)參數(shu)的(de)典(dian)型示例。最(zui)大插(cha)入壓(ya)力（MIP）通(tong)過(guo)外(wai)推圖作為初(chu)始表(biao)面壓(ya)力（i）的(de)函(han)數(shu)來(lai)確定(ding)，其(qi)中(zhong)曲(qu)線在(zai)x軸上達(da)到0值。通(tong)過(guo)在(zai)該圖的(de)斜率上添加一個(ge)來(lai)計算協同(tong)效(xiao)應(ying)。插(cha)圖：mNCS1在(zai)6.0、8.0、16.2和24.2 mN/m的(de)不(bu)同(tong)i下(xia)(xia)與(yu)DPPE單(dan)層(ceng)的(de)典(dian)型結(jie)合(he)動力學，作為達(da)到平(ping)衡（e）的(de)時(shi)間(jian)函(han)數(shu)（為清楚起見，僅顯示了(le)一些動力學）。從表(biao)面壓(ya)力的(de)增(zeng)加（–i）中(zhong)減去初(chu)始表(biao)面壓(ya)力，并(bing)繪制為時(shi)間(jian)的(de)函(han)數(shu)。

圖3比(bi)較了(le)(le)含12種不同磷脂(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)mNCS1的(de)(de)(de)(de)MIP值(zhi)(zhi)和(he)協(xie)同值(zhi)(zhi)（數值(zhi)(zhi)見表S1）。膜(mo)(mo)(mo)側壓力的(de)(de)(de)(de)估計(ji)范圍(wei)為(wei)30–35 mN/m[63–70]。因此，可以假(jia)設低于(yu)(yu)下限的(de)(de)(de)(de)MIP（30 mN/m）表明蛋白質不會穿透細胞膜(mo)(mo)(mo)。然而，MIP大(da)(da)于(yu)(yu)下限將(jiang)(jiang)表明蛋白質將(jiang)(jiang)能(neng)夠(gou)廣泛(fan)滲(shen)透到生物膜(mo)(mo)(mo)中。用(yong)(yong)PS和(he)PC脂(zhi)(zhi)(zhi)質單(dan)(dan)(dan)層(ceng)觀察到的(de)(de)(de)(de)所(suo)有MIP值(zhi)(zhi)均低于(yu)(yu)估計(ji)的(de)(de)(de)(de)膜(mo)(mo)(mo)側壓力下限(～30 mN/m），DOP除外(wai)。然而，在(zai)PE脂(zhi)(zhi)(zhi)質單(dan)(dan)(dan)層(ceng)中觀察到的(de)(de)(de)(de)MIP值(zhi)(zhi)大(da)(da)于(yu)(yu)或等(deng)于(yu)(yu)30 mN/m。這(zhe)些數據表明，mNCS1可能(neng)與(yu)由PE組(zu)(zu)成的(de)(de)(de)(de)膜(mo)(mo)(mo)結(jie)構(gou)域(yu)在(zai)生理上(shang)相互作用(yong)(yong)，與(yu)由PC和(he)PS組(zu)(zu)成的(de)(de)(de)(de)結(jie)構(gou)域(yu)不同。在(zai)mNCS1中觀察到的(de)(de)(de)(de)協(xie)同值(zhi)(zhi)證實(shi)了(le)(le)這(zhe)一趨(qu)勢(shi)。事(shi)實(shi)上(shang)，PE脂(zhi)(zhi)(zhi)質單(dan)(dan)(dan)分子(zi)膜(mo)(mo)(mo)的(de)(de)(de)(de)協(xie)同值(zhi)(zhi)大(da)(da)于(yu)(yu)PS和(he)PC脂(zhi)(zhi)(zhi)質單(dan)(dan)(dan)分子(zi)膜(mo)(mo)(mo)的(de)(de)(de)(de)協(xie)同值(zhi)(zhi)，DO脂(zhi)(zhi)(zhi)肪酰(xian)(xian)基鏈(lian)除外(wai)。此外(wai)，與(yu)四(si)種PE脂(zhi)(zhi)(zhi)質單(dan)(dan)(dan)分子(zi)膜(mo)(mo)(mo)觀察到的(de)(de)(de)(de)協(xie)同值(zhi)(zhi)相當高。這(zhe)些數據證實(shi)了(le)(le)mNCS1對PE脂(zhi)(zhi)(zhi)質單(dan)(dan)(dan)分子(zi)膜(mo)(mo)(mo)更好的(de)(de)(de)(de)結(jie)合作用(yong)(yong)。這(zhe)種趨(qu)勢(shi)可以用(yong)(yong)PE特性來解釋，PE特性是一種廣泛(fan)存在(zai)于(yu)(yu)神經元膜(mo)(mo)(mo)中的(de)(de)(de)(de)兩性離子(zi)極(ji)性頭(tou)群[59]。事(shi)實(shi)上(shang)，其弱位阻可以允(yun)許mNCS1插入(ru)脂(zhi)(zhi)(zhi)肪酰(xian)(xian)基鏈(lian)，而不管脂(zhi)(zhi)(zhi)肪酰(xian)(xian)基鏈(lian)如何。

圖(tu)3.在(zai)鈣存在(zai)下，使用DPP、DSP、DOPS、DDPS、DPPC、DSPC、DOPC、DDC、DDPC、DPPE、DSPE、DOPE、DOPE和DDPE單層(ceng)的(de)(de)mNCS1的(de)(de)MIP（A）和協同（B）值。MIP和synergy值的(de)(de)不確定性(xing)如第2.3節(jie)所述計算(suan)。

在(zai)DPP和(he)DPPC單分子膜的(de)存在(zai)下(xia)觀察(cha)到負協(xie)同(tong)值(zhi)(zhi)，表明NCS1與這些(xie)脂質的(de)結合(he)(he)不(bu)利。此外，提及排(pai)除(chu)壓力比提及aMIP更合(he)(he)適(shi)。實(shi)際(ji)上，協(xie)同(tong)作(zuo)(zuo)用小于0時獲得的(de)MIP可(ke)以稱為“排(pai)斥(chi)壓力”，因為它對應于蛋白質和(he)單層之間(jian)的(de)排(pai)斥(chi)。在(zai)DPP存在(zai)下(xia)觀察(cha)到的(de)強排(pai)斥(chi)（協(xie)同(tong)作(zuo)(zuo)用?0.12±0.07）可(ke)以用mNCS1的(de)電荷(he)(he)分布來(lai)解釋（圖(tu)4）。事實(shi)上，將與單分子膜相互作(zuo)(zuo)用的(de)片段可(ke)能(neng)帶負電，因此由(you)于PS極性(xing)頭基(ji)團(tuan)的(de)負電荷(he)(he)而被靜電斥(chi)力延遲。然(ran)后，分布在(zai)整(zheng)個蛋白質中(zhong)的(de)多個負電荷(he)(he)可(ke)能(neng)在(zai)蛋白質與膜的(de)結合(he)(he)和(he)定向中(zhong)發揮作(zuo)(zuo)用。相反，PC極性(xing)頭基(ji)是兩(liang)性(xing)離子，但具有很強的(de)空間(jian)位(wei)阻。這種(zhong)(zhong)構象可(ke)以解釋MIP的(de)低(di)值(zhi)(zhi)，在(zai)這種(zhong)(zhong)極性(xing)頭部基(ji)團(tuan)中(zhong)低(di)于30 mN/m，因此mNCS1結合(he)(he)PC脂質單分子膜的(de)能(neng)力降低(di)。

圖4.nmNCS1結構上的(de)正（紅色）和負（藍色）電(dian)荷（PDB 2LCP）[23]（關于(yu)此圖例中(zhong)顏色的(de)說明，讀者請參閱(yue)本(ben)文的(de)web版本(ben)）。