2. 實驗部分

2.1. 材料

純(chun)重(zhong)組人(ren)胰島素、甲(jia)醇、氯仿(fang)和鹽酸從MP Biomedical，LLC（Solon，OH）獲得。 重(zhong)組人(ren)胰島素（Catalog#199744，99.3%分析）已在大(da)腸(chang)桿菌(jun)表(biao)達系統中(zhong)產生(sheng)，并使用(yong)親(qin)和純(chun)化(hua)進行純(chun)化(hua)。 所有化(hua)學(xue)品均(jun)為(wei)試劑級，使用(yong)時(shi)無需進一(yi)步純(chun)化(hua)。 用(yong)于子階段(duan)制(zhi)備的水來(lai)自Modulab 2020水凈(jing)化(hua)系統（德克薩斯州圣(sheng)安(an)東(dong)尼奧(ao)大(da)陸水系統公司）。 純(chun)化(hua)水的表(biao)面張力為(wei)72.6 mN·m ? 1在20.0±0.5°C，電阻(zu)率為(wei)18 MΩ·cm，pH值為(wei)5.6時(shi)。

2.2. 方法

FITC人胰(yi)島素(su)結(jie)合程序。 通過FITC-HI的(de)表觀熒(ying)光(guang)檢測HI-Langmuir單層的(de)形貌。 由(you)于(yu)胰(yi)島素(su)是(shi)非熒(ying)光(guang)的(de)，所以必(bi)須附(fu)加一個熒(ying)光(guang)團(tuan)才能使(shi)用(yong)熒(ying)光(guang)顯微鏡。 常用(yong)的(de)蛋(dan)白質(zhi)探針是(shi)異(yi)硫氰酸熒(ying)光(guang)素(su)（FITC）。

FITC共(gong)軛HI的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)制備方法如(ru)下。 在PBS溶(rong)(rong)液(ye)(ye)中(zhong)(zhong)分(fen)(fen)(fen)別制備FITC（1 mg/mL）和(he)HI（0.3 mg/mL）溶(rong)(rong)液(ye)(ye)。 用鋁箔覆蓋FITC溶(rong)(rong)液(ye)(ye)和(he)任何(he)含有(you)FITC的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)溶(rong)(rong)液(ye)(ye)，以防止(zhi)熒光(guang)(guang)探針(zhen)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)光(guang)(guang)降(jiang)解。 將(jiang)FITC溶(rong)(rong)液(ye)(ye)逐滴加入胰島素溶(rong)(rong)液(ye)(ye)中(zhong)(zhong)并(bing)攪拌1小時。 這兩種(zhong)(zhong)溶(rong)(rong)液(ye)(ye)在FITC與胰島素的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)摩(mo)(mo)爾(er)比(bi)為(wei)0.5:1至(zhi)4:1的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)范(fan)圍(wei)(wei)內(nei)相互(hu)混合。 攪拌后，溶(rong)(rong)液(ye)(ye)通(tong)過G-25 Sephadex柱(zhu)（球狀蛋白(bai)范(fan)圍(wei)(wei)：1×103至(zhi)5×103 Da）按以下順序按重量(liang)分(fen)(fen)(fen)離：FITC-HI、HI和(he)FITC。 當流(liu)(liu)經葡聚糖凝膠(jiao)柱(zhu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)其中(zhong)(zhong)一種(zhong)(zhong)組分(fen)(fen)(fen)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)質量(liang)高于(yu)(yu)該范(fan)圍(wei)(wei)時，這些組分(fen)(fen)(fen)將(jiang)首先(xian)流(liu)(liu)出。 G-25葡聚糖凝膠(jiao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)最(zui)大范(fan)圍(wei)(wei)為(wei)5000da； 然(ran)而(er)，HI的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)摩(mo)(mo)爾(er)質量(liang)為(wei)5870 g mol ? 1. 三個組成部(bu)(bu)分(fen)(fen)(fen)中(zhong)(zhong)有(you)兩個高于(yu)(yu)5000 Da，即HI-FITC和(he)HI。 因此，最(zui)重的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)組分(fen)(fen)(fen)HI-FITC將(jiang)首先(xian)流(liu)(liu)出色(se)譜柱(zhu)，然(ran)后流(liu)(liu)出HI。 最(zui)輕的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)成分(fen)(fen)(fen)是FITC和(he)FITC碎片(pian)，它們保(bao)留在柱(zhu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)頂(ding)部(bu)(bu)，如(ru)柱(zhu)頂(ding)部(bu)(bu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)亮綠色(se)發光(guang)(guang)所示(shi)。 柱(zhu)上(shang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)紫外光(guang)(guang)顯示(shi)三個不(bu)同區域(yu)：柱(zhu)底(di)部(bu)(bu)附近的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)熒光(guang)(guang)綠色(se)區域(yu)，對應(ying)于(yu)(yu)FITC-HI，其上(shang)方的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)非熒光(guang)(guang)部(bu)(bu)分(fen)(fen)(fen)對應(ying)于(yu)(yu)未共(gong)軛于(yu)(yu)FITC的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)HI，以及柱(zhu)頂(ding)部(bu)(bu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)熒光(guang)(guang)黃色(se)區域(yu)，對應(ying)于(yu)(yu)未共(gong)軛于(yu)(yu)HI的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)FITC。 使用PBS緩沖(chong)液(ye)(ye)運行色(se)譜柱(zhu)，收(shou)集體積為(wei)1mL的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)等分(fen)(fen)(fen)試樣。

熒光(guang)(guang)光(guang)(guang)譜法用于(yu)選擇含有(you)FITC-HI的小(xiao)份樣品(pin)。 FITC探針(zhen)(zhen)在(zai)494nm激發時顯示出517nm的發射。 人(ren)們注意到(dao)，當探針(zhen)(zhen)與(yu)HI共(gong)軛時，FITC發射的強度增加。 吸(xi)收光(guang)(guang)譜法用于(yu)確定HI與(yu)FITC的比率，該比率由下式計(ji)算(suan)得出。21

其中MolWtHI=5870 g mol ? 1和(he)ε280，HI和(he)ε495，FITC分別為17335和(he)90000。 A495和(he)A280分別是共(gong)軛物和(he)HI在(zai)494和(he)280 nm處的吸(xi)光度(du)。 考慮到FITC在(zai)280 nm處的吸(xi)光度(du)，校正系數為0.35×A495。 制備(bei)了各(ge)種共(gong)軛物（FITC x-HI），x代表每HI結合的FITC分子(zi)的平均數量(liang)。 一個(ge)已經準備(bei)好了1個(ge) ? 10個(ge)FITC分子(zi)與HI分子(zi)相(xiang)連，但(dan)具有1個(ge)FITC分子(zi)的HI共(gong)軛物主要用于表觀熒光顯微鏡(jing)實驗。

朗繆爾(er)單(dan)(dan)層(ceng)制(zhi)備。 Langmuir單(dan)(dan)層(ceng)實驗(yan)中(zhong)使(shi)用(yong)的(de)HI溶(rong)液濃度為(wei)0.30 mg/mL，通(tong)過將(jiang)HI粉(fen)末溶(rong)解在鹽(yan)酸(suan)水溶(rong)液（pH 2）中(zhong)制(zhi)備。 對于作為(wei)朗繆爾(er)單(dan)(dan)層(ceng)進行(xing)的(de)所有實驗(yan)，亞相（純(chun)水）的(de)pH值為(wei)5.6。 Kibron槽(cao)和KSV槽(cao)的(de)鋪(pu)展液體積(ji)分別為(wei)80和40μL。 HI溶(rong)液在空氣中(zhong)擴(kuo)散(san) ? 水界面(mian)，使(shi)用(yong)100μL注射器（Hamilton Co.，Reno，Nevada），在亞相表面(mian)均勻沉積(ji)小液滴，然后等(deng)待15分鐘，以(yi)使(shi)Langmuir單(dan)(dan)層(ceng)達到平衡。 壓縮率設定為(wei)10mm·min ? 1. 所有等(deng)溫線和原(yuan)位(wei)紫(zi)外(wai)光譜(pu) ? 在溫度（20.0±0.5℃）和濕度（50±1%）保持恒定的(de)潔凈(jing)室(shi)（1000級）中(zhong)進行(xing)可(ke)見光、熒光和輻照光譜(pu)測量。

表(biao)面(mian)化學和光譜(pu)學方(fang)法。 使用面(mian)積為(wei)5.9 cm×21.1 cm的Kibronμ-槽（Kibron Inc.，芬蘭赫爾(er)辛基(ji)）測量表(biao)面(mian)壓(ya)力 ? 面(mian)積（π） ? A） 等(deng)溫(wen)線(xian) ? 減壓(ya)周期和穩定性研究(jiu)。 表(biao)面(mian)電(dian)位 ? 面(mian)積（ΔV ? A） 使用由電(dian)容式系統組成的開爾(er)文探針在Kibron槽上獲(huo)得等(deng)溫(wen)線(xian)。 振(zhen)動板設置在朗繆爾(er)單層表(biao)面(mian)上方(fang)約1 mm處(chu)，鍍金槽底座用作(zuo)對電(dian)極。

空(kong)氣(qi)中的(de)(de)光(guang)(guang)(guang)(guang)譜(pu)(pu)(pu)測(ce)量 ? 使用(yong)HP 8452 A型紫外(wai)分(fen)光(guang)(guang)(guang)(guang)光(guang)(guang)(guang)(guang)度(du)計(ji)獲(huo)得(de)水界面(mian) ? vis和Fluorog-3熒(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)分(fen)光(guang)(guang)(guang)(guang)光(guang)(guang)(guang)(guang)度(du)計(ji)（Horiba Scientific，愛迪生(sheng)，新澤西州(zhou)）用(yong)于熒(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)。 HI-Langmuir單(dan)層膜(mo)在空(kong)氣(qi)中的(de)(de)熒(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)光(guang)(guang)(guang)(guang)譜(pu)(pu)(pu) ? 使用(yong)面(mian)積為0.25 cm2的(de)(de)分(fen)叉光(guang)(guang)(guang)(guang)纖(xian)測(ce)量水界面(mian)，并(bing)將其放(fang)置在亞相表面(mian)上(shang)方(fang)1 mm處。 激發光(guang)(guang)(guang)(guang)通(tong)過光(guang)(guang)(guang)(guang)纖(xian)從光(guang)(guang)(guang)(guang)源(yuan)傳輸到(dao)朗繆爾(er)單(dan)層膜(mo)，朗繆爾(er)單(dan)層膜(mo)的(de)(de)發射光(guang)(guang)(guang)(guang)通(tong)過光(guang)(guang)(guang)(guang)纖(xian)傳回(hui)檢(jian)測(ce)器。 紫外(wai)線 ? 在Perkin Elmer Lambda 900 UV/vis/NIR光(guang)(guang)(guang)(guang)譜(pu)(pu)(pu)儀(yi)(yi)（Norwalk，CT）和Fluorog-3熒(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)光(guang)(guang)(guang)(guang)譜(pu)(pu)(pu)儀(yi)(yi)（與(yu)用(yong)于Langmuir單(dan)層的(de)(de)熒(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)光(guang)(guang)(guang)(guang)譜(pu)(pu)(pu)儀(yi)(yi)相同）上(shang)分(fen)別使用(yong)1 cm光(guang)(guang)(guang)(guang)程長度(du)的(de)(de)石英反應杯記錄水溶液的(de)(de)可見吸收光(guang)(guang)(guang)(guang)譜(pu)(pu)(pu)和熒(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)光(guang)(guang)(guang)(guang)譜(pu)(pu)(pu)。

表觀熒(ying)(ying)光顯(xian)微鏡用(yong)于觀察(cha)Langmuir單層（如有）中(zhong)區(qu)域的形成。 顯(xian)微鏡需(xu)要(yao)在樣品臺頂部放(fang)置朗繆爾(er)槽。 石英(ying)窗(chuang)允許激(ji)發光穿透亞相(xiang)，以(yi)便(bian)在空氣中(zhong)激(ji)發熒(ying)(ying)光團 ? 水(shui)界(jie)面。 實驗(yan)裝置使用(yong)Kibronμ-槽（Kibron Inc.，芬蘭(lan)赫爾(er)辛基）和(he)熒(ying)(ying)光顯(xian)微鏡（Olympus IX-FLA）相(xiang)結(jie)合。 可用(yong)于鋪展溶液的面積為5.9 cm×21.1 cm。 該熒(ying)(ying)光圖像由熱電冷(leng)卻光電Magnafire CCD相(xiang)機拍(pai)攝。

布(bu)魯斯特角(jiao)顯微鏡（BAM）用(yong)于(yu)觀察朗繆爾單層的形貌。 使用(yong)IElli-2000成(cheng)像橢偏儀在關(guan)閉補償器(qi)和(he)BAM2plus軟件的情況(kuang)下進行測量。 IElli2000系統的標(biao)準激光器(qi)是倍頻(pin)Nd:YAG激光器(qi)（50 mW輸出），使用(yong)532 nm線。

使用JASCO J-810分光旋光儀獲得圓二(er)色性（CD）光譜(pu)。 在25°C下，使用2.0 mm光程長度的石英電池(chi)，在195和(he)250 nm之間記錄(lu)光譜(pu)。

水溶液的(de)(de)(de)紅(hong)外光譜(pu)是(shi)使用衰減總反(fan)射率獲得的(de)(de)(de)。 使用生物(wu)ATR輔助裝置，將(jiang)水樣(yang)沉積在ATR晶體表(biao)面，很容易(yi)獲得紅(hong)外光譜(pu)。 靜態(tai)模式只需要15分(fen)鐘 ? 20μL水溶液； 但是(shi)，水溶液的(de)(de)(de)濃度應大于(yu)0.5 mg/mL，以確保與(yu)ATR晶體適當接觸。 水銀(yin) ? 鎘 ? 碲化物(wu)（MCT）探測(ce)器(qi)（Kolmar Technologies）的(de)(de)(de)掃(sao)描速度為5 kHz。 背景光譜(pu)為純水。 將(jiang)生物(wu)ATR細胞II置于(yu)Bruker Optics Equinox55 FTIR的(de)(de)(de)細胞室中。

紅外(wai)(wai)(wai)反射(she) ? 使(shi)用EQUINOX-55傅(fu)里葉變(bian)換紅外(wai)(wai)(wai)（FTIR）光(guang)譜儀（Bruker Optics，Billerica，MA）對(dui)Langmuir單層進行吸收光(guang)譜（IRRAS）測量，該(gai)光(guang)譜儀配備適用于空氣的(de)(de)XA-511外(wai)(wai)(wai)部反射(she)附件 ? 水(shui)界(jie)面(mian)實驗(yan)。 紅外(wai)(wai)(wai)光(guang)束聚(ju)焦(jiao)在空中 ? Kibronμ-槽的(de)(de)水(shui)界(jie)面(mian)。 反射(she)的(de)(de)紅外(wai)(wai)(wai)光(guang)束進入了(le)由液氮冷卻(que)的(de)(de)HgCdTe（MCT）探測器(qi)。 獲得的(de)(de)光(guang)譜分辨(bian)率為8 cm ? 1通過(guo)對(dui)1200個p極化掃描(miao)和(he)800個s極化掃描(miao)的(de)(de)疊加。

人胰島素的朗繆爾單分子層膜的表面化學和光譜學性質——摘要、介紹

人胰島素的朗繆爾單分子層膜的表面化學和光譜學性質——實驗部分

人胰島素的朗繆爾單分子層膜的表面化學和光譜學性質——結果和討論

人胰島素的朗繆爾單分子層膜的表面化學和光譜學性質——結論、致謝！