摘要

精(jing)(jing)(jing)子結合蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)（BSP）是(shi)牛(niu)精(jing)(jing)(jing)漿(jiang)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)主要蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)，已知其部分(fen)插(cha)入(ru)精(jing)(jing)(jing)子膜(mo)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)外(wai)小葉，并與(yu)其中(zhong)存(cun)在(zai)(zai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)含(han)膽(dan)堿脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)結合。這種(zhong)插(cha)入(ru)通過(guo)誘導精(jing)(jing)(jing)子早期獲能(neng)(neng)，對冷(leng)凍(dong)保(bao)存(cun)后的(de)(de)(de)(de)(de)(de)精(jing)(jing)(jing)液(ye)質(zhi)(zhi)量產生負面(mian)(mian)影響。BSP蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)表面(mian)(mian)性質(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)假設通過(guo)張力測定法進(jin)行(xing)了驗(yan)證：BSP蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)具有高(gao)度(du)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)表面(mian)(mian)活(huo)性。這表明BSP蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)不僅通過(guo)相互之間(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)相互作用，而(er)且由于(yu)其自(zi)身的(de)(de)(de)(de)(de)(de)表面(mian)(mian)活(huo)性，能(neng)(neng)夠到達磷(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)覆蓋(gai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)界面(mian)(mian)。BSP蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)插(cha)入(ru)精(jing)(jing)(jing)子外(wai)小葉的(de)(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)結構域是(shi)在(zai)(zai)類似Langmuir單分(fen)子膜(mo)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)仿生系統上(shang)復制的(de)(de)(de)(de)(de)(de)。BSP蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)插(cha)入(ru)可(ke)以(yi)在(zai)(zai)含(han)有膽(dan)堿脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)可(ke)壓縮流體(ti)域中(zhong)進(jin)行(xing)。單層(ceng)膜(mo)也(ye)被(bei)用來(lai)研究(jiu)BSP蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)與(yu)兩種(zhong)磷(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)組裝物的(de)(de)(de)(de)(de)(de)絡合作用：蛋(dan)(dan)(dan)(dan)黃低(di)密度(du)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)（LDL）或(huo)雞蛋(dan)(dan)(dan)(dan)磷(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)體(ti)。無論磷(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)結構（脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)或(huo)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)體(ti)）如何，BSP都不能(neng)(neng)改變膜(mo)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)結構。只有BSP蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)與(yu)磷(lin)(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酰膽(dan)堿的(de)(de)(de)(de)(de)(de)總比例是(shi)重要的(de)(de)(de)(de)(de)(de)。這兩種(zhong)螯合劑的(de)(de)(de)(de)(de)(de)區別在(zai)(zai)于(yu)它(ta)們的(de)(de)(de)(de)(de)(de)表面(mian)(mian)性質(zhi)(zhi)：LDL有很強的(de)(de)(de)(de)(de)(de)與(yu)外(wai)層(ceng)結合的(de)(de)(de)(de)(de)(de)傾向，而(er)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)體(ti)主要以(yi)相同的(de)(de)(de)(de)(de)(de)時間(jian)尺度(du)保(bao)持在(zai)(zai)本體(ti)中(zhong)。

1、介紹

精(jing)(jing)(jing)(jing)子(zi)(zi)結(jie)合蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)（BSP）是一個(ge)(ge)已(yi)知在(zai)(zai)(zai)輸卵管精(jing)(jing)(jing)(jing)子(zi)(zi)儲存(cun)庫(ku)的(de)(de)(de)(de)(de)形成和(he)精(jing)(jing)(jing)(jing)子(zi)(zi)獲能(neng)中起作(zuo)用(yong)(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)質(zhi)家族，精(jing)(jing)(jing)(jing)子(zi)(zi)成熟是受精(jing)(jing)(jing)(jing)的(de)(de)(de)(de)(de)關鍵步(bu)驟[1,2]。在(zai)(zai)(zai)牛精(jing)(jing)(jing)(jing)漿(jiang)中，根據(ju)Manjunath等人的(de)(de)(de)(de)(de)命名法[2]：BSP1[4]、BSP3[5]和(he)BSP5[6,7]分別(bie)鑒定和(he)分類了三(san)種(zhong)比例為(wei)10:1:1的(de)(de)(de)(de)(de)主(zhu)要BSP蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)[3]。BSP1和(he)BSP3的(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)觀質(zhi)量(liang)(liang)為(wei)15–16.5 kDa，BSP5的(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)觀質(zhi)量(liang)(liang)為(wei)28–30 kDa[6,8]。這三(san)種(zhong)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)質(zhi)由(you)一個(ge)(ge)獨特的(de)(de)(de)(de)(de)N端結(jie)構域(yu)和(he)兩(liang)個(ge)(ge)纖(xian)維(wei)連接蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)II型結(jie)構域(yu)組成。只有(you)三(san)種(zhong)BSP蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)的(de)(de)(de)(de)(de)N端結(jie)構域(yu)存(cun)在(zai)(zai)(zai)顯著差異[4–6]。每個(ge)(ge)纖(xian)維(wei)連接蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)II型結(jie)構域(yu)包含一個(ge)(ge)磷酰(xian)膽(dan)(dan)堿(jian)結(jie)合位點(dian)[9–14]。最(zui)后這些是BSP蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)的(de)(de)(de)(de)(de)生物學作(zuo)用(yong)(yong)所必需(xu)的(de)(de)(de)(de)(de)。事實上(shang)，精(jing)(jing)(jing)(jing)子(zi)(zi)膜的(de)(de)(de)(de)(de)外小葉在(zai)(zai)(zai)射(she)精(jing)(jing)(jing)(jing)過(guo)程中與(yu)含有(you)BSP蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)的(de)(de)(de)(de)(de)精(jing)(jing)(jing)(jing)漿(jiang)接觸[2,15]。BSP蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)與(yu)精(jing)(jing)(jing)(jing)子(zi)(zi)膜上(shang)的(de)(de)(de)(de)(de)含膽(dan)(dan)堿(jian)磷脂(zhi)（如磷脂(zhi)酰(xian)膽(dan)(dan)堿(jian)和(he)鞘磷脂(zhi)）快速(su)結(jie)合[9,12,16–19]，并(bing)通(tong)過(guo)部分插(cha)入(ru)精(jing)(jing)(jing)(jing)子(zi)(zi)質(zhi)膜的(de)(de)(de)(de)(de)外小葉[1,13,20]覆(fu)蓋精(jing)(jing)(jing)(jing)子(zi)(zi)表(biao)面。這是通(tong)向輸卵管精(jing)(jing)(jing)(jing)子(zi)(zi)儲存(cun)庫(ku)和(he)精(jing)(jing)(jing)(jing)子(zi)(zi)獲能(neng)的(de)(de)(de)(de)(de)第一個(ge)(ge)關鍵步(bu)驟。BSP蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)既可溶又能(neng)插(cha)入(ru)疏水膜的(de)(de)(de)(de)(de)事實證明BSP蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)具有(you)兩(liang)親性。因(yin)此，本研究的(de)(de)(de)(de)(de)第一部分旨在(zai)(zai)(zai)通(tong)過(guo)進行張力測(ce)量(liang)(liang)來(lai)檢驗這一假設。

BSP蛋(dan)白(bai)(bai)誘導的(de)(de)(de)(de)(de)早期獲(huo)能(neng)[21,22]對(dui)冷凍保存(cun)(cun)后(hou)(hou)的(de)(de)(de)(de)(de)精(jing)液質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)量(liang)有(you)負面影(ying)響，因為(wei)它會導致抗冷性(xing)和(he)(he)抗凍性(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)喪(sang)失[12,17,23–25]。因此(ci)，保護(hu)器的(de)(de)(de)(de)(de)存(cun)(cun)在(zai)(zai)(zai)(zai)對(dui)維(wei)持精(jing)子(zi)(zi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)量(liang)至(zhi)關(guan)重要。蛋(dan)黃被廣泛(fan)用(yong)于分離(li)(li)BSP蛋(dan)白(bai)(bai)[17,26–32]。這(zhe)種(zhong)(zhong)(zhong)隔(ge)(ge)離(li)(li)是(shi)由于蛋(dan)黃中(zhong)存(cun)(cun)在(zai)(zai)(zai)(zai)的(de)(de)(de)(de)(de)低密(mi)度脂(zhi)(zhi)(zhi)蛋(dan)白(bai)(bai)（LDL）外(wai)層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)的(de)(de)(de)(de)(de)磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)酰(xian)膽堿(jian)與BSP蛋(dan)白(bai)(bai)之(zhi)間的(de)(de)(de)(de)(de)特(te)異(yi)性(xing)和(he)(he)強(qiang)相互作用(yong)[9,12,33,34]。在(zai)(zai)(zai)(zai)某些情(qing)(qing)況下，還假設低密(mi)度脂(zhi)(zhi)(zhi)蛋(dan)白(bai)(bai)對(dui)精(jing)子(zi)(zi)早期獲(huo)能(neng)的(de)(de)(de)(de)(de)保護(hu)作用(yong)是(shi)由于富含磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)低密(mi)度脂(zhi)(zhi)(zhi)蛋(dan)白(bai)(bai)極性(xing)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)與由于外(wai)排而減少(shao)的(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)和(he)(he)膽固醇(chun)的(de)(de)(de)(de)(de)精(jing)子(zi)(zi)膜(mo)(mo)(mo)之(zhi)間的(de)(de)(de)(de)(de)交換[29]。目前，大豆卵磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)等其他磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)被用(yong)作蛋(dan)黃磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)替代品(pin)。然而，在(zai)(zai)(zai)(zai)這(zhe)種(zhong)(zhong)(zhong)情(qing)(qing)況下，脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)和(he)(he)膜(mo)(mo)(mo)之(zhi)間可能(neng)的(de)(de)(de)(de)(de)相互作用(yong)尚不清(qing)楚。因此(ci)，本研究的(de)(de)(de)(de)(de)第(di)二(er)部分旨在(zai)(zai)(zai)(zai)比(bi)較低密(mi)度脂(zhi)(zhi)(zhi)蛋(dan)白(bai)(bai)和(he)(he)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)與脂(zhi)(zhi)(zhi)膜(mo)(mo)(mo)接(jie)觸的(de)(de)(de)(de)(de)行為(wei)。為(wei)此(ci)，在(zai)(zai)(zai)(zai)空氣-緩沖液界面上的(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)單(dan)層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)被用(yong)來模擬(ni)精(jing)子(zi)(zi)膜(mo)(mo)(mo)外(wai)小葉(xie)(xie)的(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)結(jie)構(gou)域(yu)。這(zhe)種(zhong)(zhong)(zhong)方(fang)(fang)法(fa)被證明能(neng)有(you)效地復制牛精(jing)子(zi)(zi)膜(mo)(mo)(mo)外(wai)小葉(xie)(xie)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)結(jie)構(gou)域(yu)的(de)(de)(de)(de)(de)異(yi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)結(jie)構(gou)域(yu)[35]。最后(hou)(hou)一(yi)種(zhong)(zhong)(zhong)是(shi)主(zhu)要的(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)成分，即鞘磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)、膽固醇(chun)、1-棕櫚酰(xian)-2-二(er)十(shi)二(er)碳六烯(xi)基-sn-甘(gan)油(you)-3-磷(lin)酸(suan)膽堿(jian)（PC）和(he)(he)血漿(jiang)鹵素1-（1Z-十(shi)八烯(xi)基）-2-二(er)十(shi)二(er)碳六烯(xi)基-sn-甘(gan)油(you)-3-磷(lin)酸(suan)膽堿(jian)（P-PC）。在(zai)(zai)(zai)(zai)這(zhe)一(yi)單(dan)層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)中(zhong)，膽固醇(chun)和(he)(he)鞘磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)在(zai)(zai)(zai)(zai)34°C處由PC和(he)(he)P-PC的(de)(de)(de)(de)(de)液體(ti)混合物(wu)包(bao)圍，形成凝聚(ju)結(jie)構(gou)域(yu)?C.LDL和(he)(he)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)在(zai)(zai)(zai)(zai)接(jie)近生(sheng)物(wu)膜(mo)(mo)(mo)相關(guan)壓力的(de)(de)(de)(de)(de)情(qing)(qing)況下被引入單(dan)層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)下方(fang)(fang)的(de)(de)(de)(de)(de)亞相[36]。通(tong)過監測(ce)表面積(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)變化來檢測(ce)添加(jia)劑與單(dan)層(ceng)(ceng)(ceng)(ceng)膜(mo)(mo)(mo)之(zhi)間的(de)(de)(de)(de)(de)相互作用(yong)。最后(hou)(hou)，在(zai)(zai)(zai)(zai)相同(tong)(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)精(jing)子(zi)(zi)膜(mo)(mo)(mo)外(wai)小葉(xie)(xie)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)模型和(he)(he)相同(tong)(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)條件下，比(bi)較了LDL和(he)(he)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)對(dui)BSP蛋(dan)白(bai)(bai)的(de)(de)(de)(de)(de)隔(ge)(ge)離(li)(li)特(te)性(xing)。

2、材料和方法

2.1.材料

主(zhu)要(yao)構成重構膜外小葉(xie)的(de)脂(zhi)質(zhi)購自Avanti Polar Lipides（美國阿拉(la)(la)伯(bo)斯(si)特(te)市(shi)阿拉(la)(la)伯(bo)斯(si)特(te)市(shi)），并按接收時使用。化合物1-棕(zong)櫚酰-2-二(er)(er)十二(er)(er)碳(tan)(tan)六(liu)烯(xi)基(ji)(ji)-sn-甘油-3-磷酸膽(dan)(dan)堿（PC（16:0/22:6），分(fen)子(zi)量=806.1，純(chun)度>99%）和1-（1Z-十八烷基(ji)(ji)）-2-二(er)(er)十二(er)(er)碳(tan)(tan)六(liu)烯(xi)基(ji)(ji)-sn-甘油-3-磷酸膽(dan)(dan)堿PC（P-18:0/22:6，分(fen)子(zi)量=818.2，純(chun)度>99%）作為氯(lv)仿溶(rong)液(ye)（10mg-mL）獲得?1).將PC（16:0/22:6）和P-PC（18:0/22:6）的(de)儲(chu)備溶(rong)液(ye)稀釋至1.25 mg mL?1解(jie)決方(fang)案(an)。以綿羊毛膽(dan)(dan)固醇(chun)（Chol，Mw=711.0，純(chun)度>98%）和雞蛋(dan)鞘磷脂(zhi)（SM，Mw=386.7，純(chun)度>98%）為粉末(mo)。二(er)(er)者均以1.25 mg/mL的(de)濃度溶(rong)解(jie)于氯(lv)仿（HPLC級，法國瓦(wa)爾德魯伊爾Carlo Erba）?1.

低溫(wen)保(bao)護培養基由Trizma堿（173.0 mM）、一(yi)水(shui)合檸檬(meng)酸（70.0 mM）、果(guo)糖(tang)（56.0 mM）、甘油（6.4%；v/v）和抗(kang)生素(su)（青霉素(su)G鈉391 mg L）組成?1，硫酸鏈霉素(su)856 mg L?1，鹽(yan)酸林可霉素(su)204 mg L?1，硫酸大觀(guan)霉素(su)四水(shui)合物(wu)585 mg L?1）（西格瑪-奧爾德(de)里奇(qi)，法國圣昆廷(ting)法拉維(wei)爾）。將pH值(zhi)調(diao)整為6.2，其滲透壓約為1300.0 mOsm。

2.2.低密度脂蛋白的提取

根據Moussa等(deng)人的(de)(de)方案，從蛋黃中(zhong)提(ti)取低(di)(di)(di)密度(du)脂蛋白(bai)（LDL）[31]。提(ti)取后，將低(di)(di)(di)密度(du)脂蛋白(bai)濃縮(suo)提(ti)取物(wu)（22±0.5 g，相當于8.36 g干(gan)低(di)(di)(di)密度(du)脂蛋白(bai)）在低(di)(di)(di)溫保護介(jie)質（100 mL）中(zhong)稀釋。通過micro BCA蛋白(bai)質分析試劑盒（Pierce，Thermoscitific，France）對LDL樣品中(zhong)的(de)(de)蛋白(bai)質進行定量，得(de)出(chu)8.9±1.0 mg-mL?1.LDL樣品中(zhong)PC磷脂的(de)(de)含量是(shi)根據雞(ji)蛋中(zhong)PC的(de)(de)自然比例（18.4 g PC/100 g干(gan)LDL）計(ji)算(suan)得(de)出(chu)的(de)(de)，Givenbyonton等(deng)人[33]。它(ta)等(deng)于15.4克升?1份低(di)(di)(di)密度(du)脂蛋白(bai)樣品。LDL也含有一小部分PE（PC/PE 6:1）[33]。

2.3.精漿收集

從一頭(tou)Prim Holstein公牛身(shen)上(shang)收(shou)(shou)集牛精(jing)子，并(bing)立即(ji)以10000×g離心兩次，以回(hui)收(shou)(shou)上(shang)清液中的精(jing)漿。我們樣品的蛋白(bai)質含量為(wei)88.5±5.0mg-mL?1，由(you)micro BCA蛋白(bai)質分析試劑盒（Pierce，Thermoscitific，法國）測定。

2.4.脂質體的制備

脂(zhi)質體(ti)由(you)冷凍保護緩沖液中的(de)(de)(de)卵磷(lin)(lin)(lin)脂(zhi)提取物通(tong)過(guo)(guo)使用Avanti Polar Lipides（美(mei)國(guo)阿(a)(a)拉(la)巴馬(ma)州(zhou)(zhou)阿(a)(a)拉(la)巴馬(ma)州(zhou)(zhou)阿(a)(a)拉(la)巴馬(ma)州(zhou)(zhou)阿(a)(a)拉(la)巴馬(ma)州(zhou)(zhou)阿(a)(a)拉(la)巴馬(ma)州(zhou)(zhou)）的(de)(de)(de)微型擠(ji)(ji)(ji)出(chu)機(ji)擠(ji)(ji)(ji)出(chu)而(er)制備。卵磷(lin)(lin)(lin)脂(zhi)提取物由(you)磷(lin)(lin)(lin)脂(zhi)酰膽堿(jian)（73%）和(he)(he)磷(lin)(lin)(lin)脂(zhi)酰乙醇胺（11%）以及甘油(you)三酯(zhi)和(he)(he)鞘磷(lin)(lin)(lin)脂(zhi)等次(ci)要成(cheng)分(fen)(fen)(fen)組成(cheng)。提取物在(zai)(zai)低溫保護緩沖液中水合過(guo)(guo)夜，脂(zhi)質濃(nong)度分(fen)(fen)(fen)別(bie)為(wei)3.90 mg-mL?1（C1），7.28毫(hao)(hao)(hao)克(ke)/毫(hao)(hao)(hao)升(sheng)?1（C2），14.56毫(hao)(hao)(hao)克(ke)/毫(hao)(hao)(hao)升(sheng)?1（C3）和(he)(he)21.84毫(hao)(hao)(hao)克(ke)/毫(hao)(hao)(hao)升(sheng)?1（C4）。然后在(zai)(zai)超(chao)聲(sheng)波(bo)浴中對分(fen)(fen)(fen)散液進行15分(fen)(fen)(fen)鐘的(de)(de)(de)超(chao)聲(sheng)波(bo)處理(li)（Elmasonic S 30H，來(lai)自德國(guo)Singen Elma，功(gong)率為(wei)275W）。最后，在(zai)(zai)擠(ji)(ji)(ji)出(chu)機(ji)中擠(ji)(ji)(ji)出(chu)分(fen)(fen)(fen)散體(ti)（20次(ci)穿過(guo)(guo)100 nm的(de)(de)(de)膜）。分(fen)(fen)(fen)布尺(chi)寸集中在(zai)(zai)120nm，Zeta電位值為(wei)?6毫(hao)(hao)(hao)伏。在(zai)(zai)BSP存在(zai)(zai)下引入的(de)(de)(de)脂(zhi)質體(ti)量以重量表示（脂(zhi)質體(ti)分(fen)(fen)(fen)散體(ti)C1、C2、C3和(he)(he)C4分(fen)(fen)(fen)別(bie)為(wei)1.17 mg、2.18 mg、4.37 mg和(he)(he)6.55 mg的(de)(de)(de)脂(zhi)質）。不確定(ding)度為(wei)0.01 mg。

2.5.電泳

十二烷基硫酸鈉-聚(ju)丙(bing)烯酰(xian)胺凝膠(jiao)(jiao)(jiao)電(dian)泳（SDS-PAGE）在(zai)還原(yuan)條件下進(jin)行(xing)。將精漿溶(rong)解在(zai)pH值為6.8的緩(huan)沖(chong)(chong)液(ye)中，該緩(huan)沖(chong)(chong)液(ye)由(you)Tris 0.5 M、SDS 10%、甘油30%w/w和(he)溴酚藍0.4%組(zu)成(cheng)，以獲得1mg mL?1解決方(fang)案。添加(jia)9%巰(qiu)基乙醇v/v，并(bing)(bing)旋轉樣(yang)品，隨后在(zai)95℃下加(jia)熱?C 5分鐘(zhong)。然后，將10?L低(di)范(fan)圍分子量(liang)標準品（法國Souffelweyersheim Euromedex公(gong)司的試劑盒O6U-0511）和(he)10至25?L精漿裝入(ru)15%聚(ju)丙(bing)烯酰(xian)胺凝膠(jiao)(jiao)(jiao)（pH 6.8-Tris 0.5 M和(he)SDS 0.10%）中，并(bing)(bing)與由(you)Tris 0.025 M、甘氨(an)酸0.192 M和(he)SDS 0.1%組(zu)成(cheng)的pH 8.3遷移緩(huan)沖(chong)(chong)液(ye)耦合。在(zai)20 mA時進(jin)行(xing)電(dian)泳，并(bing)(bing)用考馬斯藍溶(rong)液(ye)G250對凝膠(jiao)(jiao)(jiao)進(jin)行(xing)染(ran)(ran)色。最后對染(ran)(ran)色凝膠(jiao)(jiao)(jiao)進(jin)行(xing)掃描，并(bing)(bing)使用Multi-Gauge軟(ruan)件（2.0版，日本富士照片膠(jiao)(jiao)(jiao)片有限公(gong)司）評估峰值強度(du)。

2.6.表面活性測量

吉布斯(si)膜（由精漿溶液擴散到空氣-緩(huan)沖界面形成）的(de)表(biao)面張力(li)在(zai)安裝在(zai)朗繆(mou)爾天平（Microtoul XL-LB，Kibron Inc.，Helsinki，芬(fen)蘭(lan)）上的(de)15孔板（帶特(te)氟隆邊(bian)緣(yuan)的(de)鋁底多(duo)孔板）上測(ce)(ce)量(liang)，該天平配有高(gao)靈敏度傳感器（使用(yong)合金絲的(de)Wilhelmy方(fang)法(fa)）。該裝置(zhi)被放置(zhi)在(zai)一(yi)個(ge)(ge)溫(wen)度控制區，固定在(zai)23°C?C，并用(yong)純蒸(zheng)餾水(shui)（美國(guo)密理博公司Milli-Q系統）校準。測(ce)(ce)量(liang)精度為(wei)(wei)0.1 mN/m。將精漿放入第(di)一(yi)個(ge)(ge)孔中(zhong)，然后在(zai)下一(yi)個(ge)(ge)孔中(zhong)用(yong)因子2稀釋，依此類(lei)推（每個(ge)(ge)孔的(de)體積(ji)為(wei)(wei)300?L）。每種(zhong)精漿提取物重復測(ce)(ce)量(liang)4次（n=2）。結果表(biao)示(shi)為(wei)(wei)所(suo)有測(ce)(ce)量(liang)的(de)平均值。

蛋白質膜的壓(ya)縮等溫線是在(zai)之前配備(bei)傳感器的朗繆爾(er)槽（MicroTour XL-LB，Kibron Inc.，芬蘭(lan)赫爾(er)辛基(ji)）上測(ce)量(liang)的。精漿首先在(zai)冷凍(dong)保存緩沖液（1/100）中(zhong)稀釋(shi)，并在(zai)緩沖液表(biao)面逐滴（50?L）擴散。平衡20分鐘后，在(zai)室溫下（23℃）記錄壓(ya)縮等溫線?C）。

2.7.精子膜外小葉脂質結構域的重建

精(jing)子(zi)(zi)膜外小葉的脂(zhi)質結構域如(ru)前(qian)所(suo)述重建(jian)[35]。朗(lang)格繆爾槽（302LL，NIMA技術，英(ying)國）被(bei)插入一個自制的手(shou)套箱(xiang)上，放(fang)置(zhi)在抗振(zhen)動臺上，用(yong)氬氣沖洗，以(yi)避免脂(zhi)質氧化。表面壓(ya)(ya)力(li)(li)的測量精(jing)度(du)(du)為(wei)0.1 mN/m，使用(yong)濾紙制成的一塊極(ji)板（英(ying)國肯特郡邁德斯(si)通(tong)惠特曼(man)國際(ji)有限公(gong)司生產的無灰惠特曼(man)色譜紙）與電子(zi)(zi)天平(ping)(ping)相(xiang)(xiang)連。環境溫(wen)度(du)(du)固定(ding)(ding)在20℃?C.將(jiang)(jiang)(jiang)所(suo)有燒瓶和(he)注射(she)器(qi)(qi)放(fang)入手(shou)套箱(xiang)中(zhong)(zhong)，然后在攤鋪單(dan)層(ceng)之前(qian)用(yong)氬氣將(jiang)(jiang)(jiang)手(shou)套箱(xiang)脫(tuo)氣1小時。朗(lang)繆爾天平(ping)(ping)的溫(wen)度(du)(du)由設(she)置(zhi)為(wei)40℃的循環水系(xi)統進(jin)行(xing)恒(heng)溫(wen)控制?C.緩沖液(ye)(ye)表面的實際(ji)溫(wen)度(du)(du)為(wei)34℃?C.亞(ya)相(xiang)(xiang)由低溫(wen)保護介質組(zu)成。以(yi)適當的摩爾比(bi)（31:14:16:39）將(jiang)(jiang)(jiang)膽固醇(chun)、鞘(qiao)磷脂(zhi)、P-PC（18:0/22:6）和(he)PC（16:0/22:6）的氯仿溶液(ye)(ye)用(yong)25?L微(wei)型注射(she)器(qi)(qi)（精(jing)確到0.5?L）逐滴地分(fen)(fen)散到緩沖液(ye)(ye)亞(ya)相(xiang)(xiang)上（Hamilton Bonaduz AG，Bonaduz，Switzterland）。單(dan)層(ceng)保持平(ping)(ping)衡10分(fen)(fen)鐘，然后以(yi)40 cm2/min的屏障速度(du)(du)開始壓(ya)(ya)縮。一旦達到目標壓(ya)(ya)力(li)(li)（25 mN/m），通(tong)過(guo)調整可移動屏障的表面積保持壓(ya)(ya)力(li)(li)恒(heng)定(ding)(ding)。由于單(dan)分(fen)(fen)子(zi)(zi)層(ceng)在30 mN/m時不夠穩(wen)定(ding)(ding)，這是(shi)與雙層(ceng)中(zhong)(zhong)脂(zhi)質堆積密度(du)(du)相(xiang)(xiang)關的膜壓(ya)(ya)力(li)(li)[36]，我們將(jiang)(jiang)(jiang)目標壓(ya)(ya)力(li)(li)降低到25 mN/m，其中(zhong)(zhong)單(dan)分(fen)(fen)子(zi)(zi)層(ceng)更穩(wen)定(ding)(ding)（見結果）。

一(yi)旦達到(dao)目標壓(ya)(ya)力(li)（25 mN/m），將(jiang)(jiang)其保持1000 s，然(ran)后(hou)使用(yong)彎(wan)曲(qu)針管將(jiang)(jiang)生(sheng)物分(fen)子(zi)(zi)（LDL、BSP或脂質體）溶液(ye)引入亞(ya)相(xiang)(xiang)。針頭彎(wan)曲(qu)遠離(li)針尖(jian)，并位于槽的(de)底部(bu)，以便在(zai)壓(ya)(ya)縮的(de)亞(ya)相(xiang)(xiang)下方進(jin)行(xing)注射(she)。之前將(jiang)(jiang)當量(liang)體積(ji)(ji)（每(mei)種(zhong)添加(jia)劑0.3 mL）移到(dao)屏(ping)障后(hou)面(mian)。注射(she)生(sheng)物分(fen)子(zi)(zi)后(hou)，監測每(mei)個(ge)脂質分(fen)子(zi)(zi)的(de)面(mian)積(ji)(ji)變化，并表(biao)示為(wei)相(xiang)(xiang)對于初始值的(de)變化（a/a=（a?A（t0）×100/A（t0）。它(ta)已經被跟蹤了3000秒，相(xiang)(xiang)當于冷凍保存前處(chu)理精(jing)液(ye)的(de)時間。在(zai)這種(zhong)恒壓(ya)(ya)模式下，生(sheng)物分(fen)子(zi)(zi)插入脂質單層(ceng)導致膜壓(ya)(ya)力(li)增(zeng)加(jia)，而(er)膜壓(ya)(ya)力(li)通過增(zeng)加(jia)表(biao)面(mian)積(ji)(ji)而(er)降低(di)。相(xiang)(xiang)反(fan)，如果生(sheng)物分(fen)子(zi)(zi)導致脂質單層(ceng)溶解(jie)在(zai)亞(ya)相(xiang)(xiang)中，表(biao)面(mian)積(ji)(ji)就會減小。重復所有數據，偏(pian)差不超過表(biao)面(mian)積(ji)(ji)的(de)5%。

2.8.低溫透射電子顯微鏡（Cryo TEM）

使用(yong)(yong)低(di)溫插入式低(di)溫固(gu)定裝置（美國(guo)加坦(tan)）制備(bei)(bei)用(yong)(yong)于(yu)低(di)溫TEM觀察的(de)(de)試樣(yang)，其(qi)中(zhong)(zhong)一滴水懸浮(fu)液(ye)沉積在輝(hui)光放電多孔(kong)(kong)型碳(tan)涂層格(ge)(ge)柵(zha)（美國(guo)Ted Pella公司）上。然(ran)后，通過(guo)將(jiang)含有試樣(yang)的(de)(de)液(ye)滴吸干(gan)到支(zhi)撐碳(tan)膜(mo)孔(kong)(kong)上殘留的(de)(de)薄(bo)層液(ye)體(ti)上，制備(bei)(bei)TEM網格(ge)(ge)。通過(guo)將(jiang)格(ge)(ge)柵(zha)快速插入液(ye)氮冷卻的(de)(de)液(ye)態乙烷中(zhong)(zhong)，使液(ye)膜(mo)玻(bo)璃(li)化(hua)(hua)。玻(bo)璃(li)化(hua)(hua)標本安裝在Gatan 910標本架(jia)（美國(guo)Gatan）中(zhong)(zhong)，使用(yong)(yong)CT-3500-cryotransfer系(xi)統（美國(guo)Gatan）將(jiang)其(qi)插入顯微鏡中(zhong)(zhong)，并用(yong)(yong)液(ye)氮冷卻。然(ran)后從保存在玻(bo)璃(li)質冰中(zhong)(zhong)并懸浮(fu)在支(zhi)撐碳(tan)基質上的(de)(de)孔(kong)(kong)中(zhong)(zhong)的(de)(de)標本獲得TEM圖(tu)像。

在(zai)低劑量(liang)條件下(xia)觀(guan)察(cha)樣品（<10 e?/A2），在(zai)?178?C、使用(yong)JEM 1230“Cryo”顯(xian)微鏡（日本Jeol），在(zai)80 kV電壓(ya)下(xia)運行，并配(pei)備LaB6燈絲。所有顯(xian)微照片均記錄在(zai)Gatan 1.35K×1.04K×12位ES500W CCD相機上。為確保觀(guan)察(cha)的(de)(de)良好重(zhong)復性，從(cong)幾(ji)個(ge)樣品制備中采集了一(yi)系(xi)列超過50張的(de)(de)圖(tu)像，放(fang)大率不同。